Natural variation in monoterpene synthesis in kiwifruit: transcriptional regulation of terpene synthases by NAC and EIN3-like transcription factors
- 作者
- Niels J. Nieuwenhuizen, Xiuyin Chen, Mindy Y. Wang, Adam J. Matich, Ramon Lopez Perez, Andrew C. Allan, Sol A. Green, Ross G. Atkinson
- 单位
- The New Zealand Institute for Plant & Food Research Limited (PFR), Private Bag 92169, Auckland, New Zealand; School of Biological Sciences, University of Auckland, Private Bag 92019, Auckland 1142, New Zealand; PFR, Private Bag 11600, Palmerston North, New Zealand; German Cancer Research Center, Clinical Cooperation Unit Molecular Radiooncology, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany
- 杂志
- Plant Physiology（2015）
- DOI
- 10.1104/pp.114.254367
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析猕猴桃果实单萜合成自然变异的转录调控机制，解释为什么A. arguta成熟果实产生大量单萜而A. chinensis产生极少量单萜。
研究策略
比较两个萜烯谱差异巨大的猕猴桃品种（A. arguta 'Hortgem Tahi' 和 A. chinensis 'Hort16A'），结合果实发育/成熟过程中的挥发物分析、基因和蛋白表达谱、体外酶活、瞬时共表达、启动子比较和EMSA等，鉴定调控单萜合成的关键基因和转录因子。
核心内容
该研究比较了单萜积累差异巨大的两个猕猴桃品种，解析了果实单萜合成自然变异的转录调控机制。A. arguta成熟果实单萜释放速率约为1000 ng gFW⁻¹ h⁻¹，其中terpinolene占59%，而A. chinensis仅约7 ng gFW⁻¹ h⁻¹。通过挥发物分析、基因表达谱、体外酶活、瞬时共表达及EMSA等实验，发现A. arguta中萜烯合酶AaTPS1的高表达和MEP途径关键酶DXS的限速作用是高单萜积累的基础，共表达AcDXS1和AaTPS1可使单萜产量比单独表达AaTPS1提高逾100倍。进一步研究表明，NAC和EIN3-like转录因子可结合并激活AaTPS1启动子，其中NAC2/3/4识别启动子中28 bp片段内的ACGT核心基序；而A. chinensis的AcTPS1启动子该核心序列发生突变（ACGTA→ACATA），丧失NAC结合与激活能力，导致AcTPS1表达量极低，这是其低单萜积累的直接原因。该工作揭示了天然启动子变异对果实风味性状的决定性影响，为猕猴桃风味改良提供了分子靶点。
创新点
首次揭示了NAC转录因子通过结合萜烯合成酶基因启动子调控果实单萜合成；发现DXS是猕猴桃MEP途径的关键限速酶；阐明了A. chinensis中AcTPS1启动子NAC结合位点突变导致其低表达和低单萜积累的分子机制；证明天然启动子变异可显著影响果实重要风味性状。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Actinidia arguta 'Hortgem Tahi' | 单萜合成 / MEP途径 | AaTPS1 | AaTPS1 | 催化 | 编码以terpinolene为主要产物的单萜合酶，成熟期表达和蛋白积累显著上调 |
| Actinidia chinensis 'Hort16A' | 单萜合成 / MEP途径 | AcTPS1 | AcTPS1 | 催化 | 与AaTPS1高度同源但产物主要为geraniol和β-myrcene，在果实中低表达 |
| Actinidia arguta 'Hortgem Tahi' / Actinidia chinensis 'Hort16A' | MEP途径 | AcDXS1 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | 果实成熟期表达上调>20倍，共表达使AaTPS1单萜产量提高>100倍，是MEP通量关键限速酶 |
| Actinidia arguta / Actinidia chinensis | MEP途径 | AaDXR1 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 (DXR) | 催化 | 与AaTPS1共表达使单萜产量提高约2倍 |
| Nicotiana benthamiana | 调控 | AaNAC2, AaNAC3, AaNAC4 | NAC转录因子 | 调控 | 通过结合AaTPS1启动子28 bp片段（含ACGTA核心）激活启动子；在AcTPS1启动子中因核心突变不能结合 |
| Nicotiana benthamiana | 调控 | AaNAC1 | NAC1 | 调控 | 不结合28 bp启动子片段，但可激活AaTPS1启动子，可能结合其他位点 |
| Nicotiana benthamiana | 调控 | AcEIL1-4 / AaEIL4 | EIN3-like (EIL) 转录因子 | 调控 | 可激活AaTPS1启动子3-6倍，对AcTPS1启动子激活弱 |
| Escherichia coli | 体外蛋白表达 | AaTPS1, AcTPS1 | 重组AaTPS1/AcTPS1 | 催化 | 用于酶活测定和抗体生产；AaTPS1以Mg2+为辅因子时活性更高，AcTPS1偏好Mn2+ |
关键发现
- A. arguta成熟果实单萜释放速率约1000 ng gFW-1 h-1，而A. chinensis仅约7 ng gFW-1 h-1
- A. arguta果实萜烯谱以terpinolene为主（占59%），体外AaTPS1产物中terpinolene约占67%
- AcTPS1与AaTPS1氨基酸一致性88.7%
- AcTPS1在幼果中表达量不足AaTPS1的1/1000，且在成熟果实中不表达
- 瞬时共表达AcDXS1和AaTPS1使单萜产量比单独表达AaTPS1提高>100倍
- 共表达AcDXR1仅提高约2倍
- DXS在果实成熟期表达上调>20倍
- NAC1-4在成熟过程中诱导3-74倍
- EIL诱导2-6倍
- AaTPS1启动子被NAC和EIL转录因子激活3-6倍
- EMSA显示AaNAC2/3/4结合AaTPS1启动子28 bp片段（含ACGT核心），而AcTPS1启动子核心突变（ACGTA→ACATA）失去结合和激活能力
- 在AcTPS1启动子中重新插入12 bp NAC核心基序的5个串联拷贝可恢复NAC激活。
研究结论
A. arguta成熟果实高单萜积累依赖于AaTPS1的高表达和DXS介导的MEP底物流量增加，其启动子含有效的NAC结合位点；而A. chinensis中AcTPS1启动子NAC核心结合位点突变导致无法被NAC激活，从而低表达、低单萜。NAC转录因子在调控猕猴桃果实单萜合成及其他成熟性状中起关键作用。