Comparative transcriptomics unravel biochemical specialization of leaf tissues of Stevia (Stevia rebaudiana) for diterpenoid production
- 作者
- Mi Jung Kim, Jingjing Jin, Junshi Zheng, Limsoon Wong, Nam-Hai Chua, In-Cheol Jang
- 单位
- Temasek Life Sciences Laboratory; School of Computing, National University of Singapore; Department of Biological Sciences, National University of Singapore; Laboratory of Plant Molecular Biology, The Rockefeller University
- 杂志
- Plant Physiology（2015）
- DOI
- 10.1104/pp.15.01353
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甜叶菊叶片中甜菊糖苷（SGs）和其他labdane型二萜类化合物的生物合成途径及空间分布尚不清楚，特别是不同叶片组织（毛状体与叶肉细胞）中的代谢分工和特异性基因表达。
研究策略
通过代谢物分析（HPLC和GC-MS）与RNA-seq转录组分析相结合，比较甜叶菊叶片毛状体（T）和去毛状体叶片组织（L-T）的代谢物与基因表达谱，结合系统发育树、qRT-PCR、体外酶活测定和本氏烟草体内瞬时表达验证关键二萜合酶的功能。
核心内容
该研究通过整合代谢物分析和RNA-seq转录组测序，系统解析了甜叶菊叶片不同组织的二萜代谢分工。代谢物检测显示甜菊糖苷主要积累于叶肉细胞，毛状体则特异性积累manoyl oxide等labdane型二萜。转录组组装获得53,793个unigenes，差异表达分析发现毛状体中超过20%的unigenes特异性表达。研究鉴定出毛状体特异性表达的新二萜合酶基因SrCPS2和SrKSL，体外酶活与本氏烟草瞬时表达证明SrCPS2为labda-13-en-8-ol二磷酸合酶，与SrKSL协同催化生成manoyl oxide和epi-manoyl oxide。同时重新注释了MEP途径和GGPPS基因家族，发现SrDXS1在叶肉细胞中表达量比毛状体高4-5倍，而SrDXS2在毛状体中表达高200倍以上，SrGGPPS1在毛状体中高400倍以上，纠正了以往对相关基因功能的推测。该工作揭示了甜叶菊通过组织特异性代谢途径实现不同二萜类化合物分区合成的策略，避免代谢干扰，为甜叶菊高效生产多种次生代谢物提供了分子基础。
创新点
['首次整合代谢组和转录组分析甜叶菊叶片不同组织的二萜代谢，明确SGs在叶肉细胞合成和储存，而毛状体专门积累其他labdane型二萜。', '鉴定出毛状体特异性表达的新二萜合酶基因SrCPS2和SrKSL，并证明SrCPS2是labda-13-en-8-ol二磷酸合酶（LPPS），与SrKSL协同催化生成manoyl oxide和epi-manoyl oxide。', '通过系统发育和表达分析，重新注释了MEP途径和GGPPS基因家族，提出SrGGPPS3和SrDXS1等可能参与SG生物合成，纠正了以往对SrGGPPS1和SrDXS4功能的推测。', '揭示了甜叶菊叶片通过不同组织特异性代谢途径避免代谢干扰的策略。']
研究对象（23）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrDXS1 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶1 | 催化 | 主要在去毛状体叶组织（L-T）中表达，可能参与SG生物合成 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrDXS2 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶2 | 催化 | 在毛状体中高表达（>200倍），可能参与挥发性萜类生物合成 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrDXS3 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶3 | 催化 | 属于DXS3分支，功能待研究 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrDXS4 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶4 | 催化 | 先前报道为AJ429232，在毛状体中高表达 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrDXR1 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶1 | 催化 | 在T中表达略高（约2.5倍），可能参与非SG萜类合成 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrDXR2 | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶2 | 催化 | 在T中表达高20倍，与SrDXR1氨基酸一致性89.4% |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrMCT | 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | 在L-T和T中均有表达，T中略高2-4倍 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrCMK | 4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | 在T中略高 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrMDS | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 在L-T和T中表达相近 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrHDS | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶 | 催化 | 在T中略高 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrHDR1 | 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶1 | 催化 | 在T中表达略高，与SrHDR2一致性86.7% |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrHDR2 | 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶2 | 催化 | 在L-T中表达较高，可能参与SG合成 |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrIDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶1 | 催化 | 在T中高表达（>6倍），与SrIDI2一致性68.4% |
| Stevia rebaudiana | MEP途径 | SrIDI2 | 异戊烯基二磷酸异构酶2 | 催化 | 在L-T和T中均表达，可能参与SG合成 |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（GGPP合成） | SrGGPPS1 | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶1 | 催化 | 在T中高表达（>400倍），可能参与毛状体labdane型二萜合成 |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（GGPP合成） | SrGGPPS2 | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶2 | 催化 | 定位于细胞质，可能不直接参与质体二萜合成 |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（GGPP合成） | SrGGPPS3 | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶3 | 催化 | 定位于叶绿体，在L-T中表达高，可能参与SG生物合成 |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（SG/赤霉素） | SrCPS | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 参与SG/GA生物合成，在L-T中表达约5倍高 |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（labdane型） | SrCPS2 | labda-13-en-8-ol二磷酸合酶（LPPS） | 催化 | 毛状体特异性表达，与SrKSL协同生成manoyl oxide和epi-manoyl oxide |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（SG/赤霉素） | SrKS1 | 贝壳杉烯合酶1 | 催化 | 在L-T中高表达约5倍，参与SG生物合成；也可与SrCPS2反应生成manoyl oxide |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（labdane型） | SrKSL | 贝壳杉烯合酶类似蛋白（manoyl oxide合酶） | 催化 | 毛状体高表达（>8倍），与SrCPS2共同催化生成manoyl oxide类产物 |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（SG） | SrKO1 | 贝壳杉烯氧化酶1 | 催化 | 在L-T中高表达，参与steviol合成 |
| Stevia rebaudiana | 二萜生物合成（SG） | SrKAH | 贝壳杉烯酸羟化酶 | 催化 | 在L-T中高表达，催化steviol生物合成第一步 |
关键发现
- ['甜菊糖苷（SGs）主要积累在去毛状体叶片组织（L-T）中，而在毛状体（T）中几乎检测不到
- 毛状体则积累monoterpenes, sesquiterpenes和labdane型二萜如oxomanoyl oxide、agatholic acid和manoyl oxide。', 'RNA-seq共获得超过160 million条单端101 bp reads，组装得到53,793个unigenes，总长95 Mb，GC含量37.3%，N50为1,482 bp
- 其中L-T表达32,336个，T表达45,918个。', '差异表达分析显示3,807个unigenes在L-T中优先表达，10,529个在T中特异性表达（差异≥4倍），毛状体中超过20%的组装unigenes特异性表达。', 'MEP途径基因鉴定：SrDXS1在L-T中表达量比T高4-5倍
- SrDXS2在T中表达比L-T高200倍以上
- SrDXR2在T中高20倍
- SrIDI1在T中高6倍
- SrHDR1和SrIDI1更多在T表达。', 'GGPPS基因家族：SrGGPPS1在T中表达比L-T高400倍以上，且几乎不在L-T检测到
- SrGGPPS2和SrGGPPS3在L-T中更丰富，但SrGGPPS2定位于细胞质，SrGGPPS3定位于叶绿体。', '二萜合酶：SrCPS和SrKS1在L-T中表达比T高约5倍
- SrCPS2仅在T中检测到，SrKSL在T中比L-T高8倍以上
- SrKO1和SrKAH在L-T中高表达。', '体外酶活证明SrCPS2是labda-13-en-8-ol二磷酸合酶（LPPS），与SrKSL联合催化生成manoyl oxide和epi-manoyl oxide
- 在本氏烟草体内共表达也得到相同产物。', 'SrCPS2与SrCPS氨基酸一致性为56.1%，SrKSL与SrKS1为61.2%
- SrDXR1/2为89.4%，SrHDR1/2为86.7%，SrIDI1/2为68.4%。']
研究结论
甜叶菊叶片中不同组织具有不同的二萜代谢途径：SGs在叶肉细胞中通过MEP途径和SrCPS/SrKS1等酶合成并储存，而毛状体则通过特异性表达的SrCPS2和SrKSL等酶合成manoyl oxide等labdane型二萜。这种组织特异性代谢分工有效避免了代谢干扰，为甜叶菊高效生产多种次生代谢物提供了基础。