A Single Amino Acid Substitution in an ORANGE Protein Promotes Carotenoid Overaccumulation in Arabidopsis
- 作者
- Hui Yuan, Katherine Owsiany, T E Sheeja, Xiangjun Zhou, Caroline Rodriguez, Yongxi Li, Ralf Welsch, Noam Chayut, Yong Yang, Theodore W Thannhauser, Mandayam V. Parthasarathy, Qiang Xu, Xiuxing Deng, Zhangjun Fei, Ari Schaffer, Nurit Katzir, Joseph Burger, Yaakov Tadmor, Li Li
- 单位
- Robert W. Holley Center for Agriculture and Health, USDA-ARS, Cornell University; Plant Breeding and Genetics Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University; Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (MOE), Huazhong Agricultural University; University of Freiburg, Faculty of Biology II; Newe Ya'ar Research Center, ARO; Plant Biology Section, School of Integrative Plant Science, Cornell University; Boyce Thompson Institute for Plant Research, Cornell University
- 杂志
- Plant Physiology（2015）
- DOI
- 10.1104/pp.15.00971
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型OR蛋白促进类胡萝卜素积累能力有限，而自然突变体BoOR_MUT携带有大反转座子插入且导致矮化，难以应用；需要开发一种简单有效的突变OR来大幅度提高植物类胡萝卜素（特别是β-胡萝卜素）含量。
研究策略
通过定点突变将AtOR和SbOR中保守的精氨酸替换为组氨酸或丙氨酸，在拟南芥愈伤组织中过表达，利用HPLC、Western blot、qRT-PCR、Y2H/BiFC和透射电镜等系统分析其表型、类胡萝卜素含量、PSY蛋白水平和活性、以及质体超微结构。
核心内容
该研究通过定点突变将拟南芥和高粱OR蛋白中保守的精氨酸替换为组氨酸或丙氨酸，并在拟南芥愈伤组织中过表达，以开发能大幅提高类胡萝卜素含量的新策略。结果显示，单氨基酸替换R90H或R90A即赋予OR蛋白促进类胡萝卜素过量积累的新功能：AtORHis系总类胡萝卜素达野生型的6.7倍，而AtOR仅为1.6倍，β-胡萝卜素比例也由野生型的26%升至约50%。尽管AtOR和AtORHis均同等程度提高PSY蛋白丰度，但未检测到PSY活性增强，透射电镜显示AtORHis特异诱导膜状有色体形成，而AtOR仅产生含较大嗜锇小球的结构。其他突变（如R88H、R90F、R90K等）均无此效果。这表明OR蛋白中单个精氨酸的替换通过诱导膜状有色体生物发生、扩大类胡萝卜素储存库容来促进积累，而非增强合成酶活性，为作物营养品质改良提供了简单有效的遗传工具。
创新点
发现OR蛋白中单个保守精氨酸被His或Ala替换即可增强促进类胡萝卜素过量积累的新功能；证明该功能与诱导膜状有色体生物发生有关，而不是通过增强PSY活性；建立了拟南芥愈伤组织作为研究有色体生物发生和类胡萝卜素积累的高效系统。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 类胡萝卜素生物合成 | AtOR | ORANGE (OR) protein | 调控 | 野生型OR促进愈伤组织类胡萝卜素积累至多2倍 |
| 拟南芥 | 类胡萝卜素生物合成 | AtOR^His (R90H) | AtOR^His 蛋白 | 调控 | 单氨基酸替换，导致总类胡萝卜素达野生型6.7倍，β-胡萝卜素约占50% |
| 拟南芥 | 类胡萝卜素生物合成 | AtOR^Ala (R90A) | AtOR^Ala 蛋白 | 调控 | 类似AtOR^His，β-胡萝卜素约占55% |
| 拟南芥 | 类胡萝卜素生物合成 | AtOR^Phe (R90F)、AtOR^Lys (R90K)、AtOR^His(R88H)、AtOR^His(R102H)、AtOR-Like^His(R97H) | OR突变蛋白 | 调控 | 这些突变均不能诱导大量类胡萝卜素积累 |
| 拟南芥 | 类胡萝卜素生物合成 | AtPSY | 八氢番茄红素合成酶 (PSY) | 催化 | 类胡萝卜素合成途径限速酶，受OR转录后调控，蛋白丰度上调但活性未增强 |
| 高粱 (Sorghum bicolor) | 类胡萝卜素生物合成 | SbOR | ORANGE (OR) protein | 调控 | SbOR^His(R104H)同样使类胡萝卜素显著提高至多7倍 |
| 拟南芥愈伤组织 | 有色体生物发生 | — | — | 区室化 | AtOR^His诱导形成膜状有色体，为类胡萝卜素提供储存库容；AtOR无此功能 |
关键发现
- AtOR或SbOR过表达使愈伤组织总类胡萝卜素提高至多2倍
- AtORHis(R90H)或SbORHis(R104H)过表达则提高至多7倍。AtORHis系总类胡萝卜素达野生型的6.7倍，AtOR系为1.6倍
- β-胡萝卜素比例由野生型的26%升至AtOR的35%和AtORHis的约50%。AtORAla(R90A)与AtORHis效果类似，β-胡萝卜素约占55%。R88H、R102H、R90F、R90K以及AtOR-Like R97H均不能诱导大量积累。AtOR和AtORHis均等程度地提高PSY蛋白丰度，但未检测到PSY活性增强。电镜显示AtORHis诱导与橙色花椰菜突变体curd中类似的膜状有色体形成，而AtOR仅产生含较大嗜锇性质体小球的结构。
研究结论
OR蛋白中R90H或R90A单氨基酸替换使其获得通过诱导膜状有色体生物发生、增强类胡萝卜素储存库容而大幅促进类胡萝卜素（尤其β-胡萝卜素）积累的新功能，可作为作物营养品质改良的新型遗传工具。