Functional divergence of diterpene syntheses in the medicinal plant Salvia miltiorrhiza
- 作者
- Guanghong Cui, Lixin Duan, Baolong Jin, Jun Qian, Zheyong Xue, Guoan Shen, John Hugh Snyder, Jingyuan Song, Shilin Chen, Luqi Huang, Reuben J. Peters, Xiaoquan Qi
- 单位
- Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences; State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences; Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College; Department of Biochemistry, Biophysics & Molecular Biology, Iowa State University
- 杂志
- Plant Physiology（2015）
- DOI
- 10.1104/pp.15.00695
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析药用植物丹参中二萜合酶（diTPS）家族的功能多样性及其进化驱动力，阐明多个二萜代谢途径（如丹参酮、赤霉素、ent-13-epi-manoyl oxide）的分子基础。
研究策略
结合基因组鉴定、体外酶活分析、qRT-PCR表达谱、RNAi基因沉默、LC/GC-MS代谢组学、系统发育与正选择分析、分子对接及定点突变等方法。
核心内容
该研究系统解析了药用植物丹参中二萜合酶（diTPS）家族的功能分化及其进化机制。通过基因组鉴定、体外酶活、RNAi沉默、代谢组学及正选择分析等手段，发现丹参至少存在四个独立的二萜代谢途径：根部与地上部分分别由SmCPS1/SmCPS2控制的丹参酮途径、花萼中SmCPS4与SmKSL2合成的ent-13-epi-manoyl oxide途径，以及赤霉素途径。酶动力学显示SmCPS1的kcat比SmCPS2高18倍以上，而SmCPS1-RNAi使根部隐丹参酮等主要成分含量骤降至接近零。正选择分析在功能分化分支上检测到ω=5.64的显著信号，定点突变证实单一氨基酸替换（如S362W）即可使产物产量下降逾百倍，说明正选择驱动了CPS从赤霉素相关ent-CPP向药用二萜相关底物的功能转向。RNAi结合代谢组学还鉴定出21个潜在的丹参酮生物合成中间体。该工作揭示了基因复制与正选择在药用植物特化代谢途径演化中的核心作用，为丹参酮的代谢工程改造提供了明确的分子靶点。
创新点
1. 发现丹参至少有四个二萜代谢途径，包括根和地上组织分别由SmCPS1/SmCPS2控制的独立丹参酮途径；2. 首次报道SmCPS4与SmKSL2在花萼中合成ent-13-epi-manoyl oxide；3. 证明正选择驱动CPS从赤霉素相关ent-CPP向药用二萜相关CPP/LDPP的功能分化；4. RNAi结合代谢组学揭示了21个潜在的丹参酮生物合成中间体。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成（根） | SmCPS1 | SmCPS1 | 催化 | 催化GGPP环化为CPP，主要在根周皮高表达，RNAi显著降低丹参酮含量 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成（地上部分） | SmCPS2 | SmCPS2 | 催化 | 催化GGPP生成CPP，主要在幼苗叶片和花瓣中表达，与SmCPS1非冗余 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 未确定（可能无功能） | SmCPS3 | SmCPS3 | 催化 | 与SmKSL1/SmKSL2组合均未检测到产物，推测为无活性假基因 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | ent-13-epi-manoyl oxide生物合成（花萼） | SmCPS4 | SmCPS4 | 催化 | 催化GGPP生成ent-LDPP，与SmKSL2偶联生成ent-13-epi-manoyl oxide，花萼中表达最高 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 赤霉素生物合成 | SmCPS5 | SmCPS5 | 催化 | 催化GGPP生成ent-CPP，RNAi导致GA缺乏矮化表型，可被外源GA3恢复 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 丹参酮生物合成（根及地上部分） | SmKSL1 | SmKSL1 | 催化 | 与SmCPS1或SmCPS2产生的CPP偶联生成miltiradiene，缺失N端γ结构域 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza） | 赤霉素生物合成及ent-13-epi-manoyl oxide生物合成 | SmKSL2 | SmKSL2 | 催化 | 与SmCPS5偶联生成ent-kaurene（GA前体），与SmCPS4偶联生成ent-13-epi-manoyl oxide，保留γ结构域 |
关键发现
- SmCPS1与SmCPS2均能催化GGPP生成CPP，但SmCPS1的Km=0.54 μM，SmCPS2的Km=0.95 μM，SmCPS1的kcat比SmCPS2高18倍以上
- SmCPS1-RNAi使根部隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I分别从14465±995、2311±13、2010±1170 μg/g降至0.10±0.01、1.2±0.2、14±1 μg/g
- 代谢组学鉴定出21个SmCPS1依赖的二萜代谢物，其中19个为丹参酮或中间体，如miltiradiene、ferruginol、sugiol、miltirone等
- 正选择分析显示与功能分化相关的分支ω=5.64（P<0.01），SmCPS4和SmCPS1等基因上也检测到正选择信号
- SmCPS4与SmKSL2产生ent-13-epi-manoyl oxide，该化合物在花萼中含量最高，与SmCPS4表达相关系数0.97
- 定点突变表明SmCPS1的S362W突变使CPP产量降低>100倍，SmCPS5的W364S突变使ent-CPP产量降低约80倍。
研究结论
丹参二萜合酶家族通过基因复制和正选择发生功能分化，形成至少四个独立二萜途径：根部丹参酮途径（SmCPS1+SmKSL1）、地上部分丹参酮途径（SmCPS2+SmKSL1）、花萼ent-13-epi-manoyl oxide途径（SmCPS4+SmKSL2）以及赤霉素途径（SmCPS5+SmKSL2）。这些发现为丹参酮的代谢工程和定向进化提供了分子基础。