Functional diversification of kaurene synthase-like genes

作者: Baolong Jin, Guanghong Cui, Juan Guo, Jinfu Tang, Lixin Duan, Huixin Lin, Ye Shen, Tong Chen, Huabei Zhang, Luqi Huang
单位: State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs, National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
杂志: Plant Physiology（2017）
DOI: 10.1104/pp.17.00202
所属领域: 代谢工程
关键词: ent-贝壳杉烯normal-CPP二萜合酶唇形科碎米桠贝壳杉烯合成酶类似基因
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解决的核心问题

解析药用植物碎米桠（Isodon rubescens）中二萜合酶基因家族的组成与功能，阐明ent-kaurene二萜和normal-CPP介导的二萜生物合成途径及其化学多样性的进化机制。

研究策略

通过转录组测序鉴定二萜合酶（diTPS）基因，利用RACE克隆全长cDNA，构建系统发育树，进行体外酶活测定和酵母异源表达，结合qRT-PCR表达分析和GC-MS代谢产物检测，解析各基因功能并揭示结构域演化。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究通过转录组测序和分子克隆，系统鉴定了药用植物碎米桠中迄今唇形科最大的二萜合酶基因家族，包含5个柯巴基二磷酸合酶（CPS）和6个贝壳杉烯合酶类似基因（KSL）。体外酶活测定与酵母异源表达显示，IrCPS4和IrCPS5产生ent-CPP，IrCPS1和IrCPS2产生normal-CPP；IrKSL4与ent-CPP反应生成95% ent-atiserene和5% ent-kaurene，IrKSL5专一生成ent-kaurene，而IrKSL1和IrKSL3与normal-CPP合成miltiradiene，IrKSL6生成isopimaradiene。研究还鉴定出细胞色素P450酶CYP76AH30为铁锈醇合酶，可在酵母中催化miltiradiene氧化为ferruginol；叶片中冬凌草甲素含量高达干重的0.25%。值得注意的是，IrKSL3和IrKSL6虽保留完整三结构域却仅与normal-CPP反应，与双结构域的IrKSL1共存，为唇形科KSL结构域逐步缺失的进化过程提供了中间环节的直接证据，揭示了二萜化学多样性形成的分子演化机制。

创新点

首次报道唇形科植物中最大的二萜合酶基因家族（5个CPS和6个KSL）；发现IrCPS1/IrCPS2和IrKSL1/IrKSL3参与normal-CPP介导的miltiradiene合成；鉴定CYP76AH30为铁锈醇合酶；发现IrKSL3和IrKSL6保留三结构域却与正常CPP反应，为KSL结构域缺失的进化历程提供证据。

研究对象（11）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
E. coli	normal-CPP介导的二萜生物合成	IrCPS1	IrCPS1	催化	催化GGPP生成normal-CPP，与IrKSL1或IrKSL3结合生成miltiradiene
E. coli	normal-CPP介导的二萜生物合成	IrCPS2	IrCPS2	催化	催化GGPP生成normal-CPP，功能与IrCPS1类似
E. coli	ent-CPP介导的二萜生物合成	IrCPS4	IrCPS4	催化	催化GGPP生成ent-CPP，预测参与oridonin生物合成，在叶片高表达
E. coli	ent-CPP介导的二萜生物合成	IrCPS5	IrCPS5	催化	催化GGPP生成ent-CPP，可能参与GA生物合成
E. coli	normal-CPP介导的二萜生物合成	IrKSL1	IrKSL1	催化	具有βα双结构域，与normal-CPP反应生成miltiradiene，在根中高表达
E. coli	ent-CPP介导的二萜生物合成	IrKSL2	IrKSL2	催化	与ent-CPP反应生成ent-异海松二烯样化合物
E. coli	normal-CPP介导的二萜生物合成	IrKSL3	IrKSL3	催化	具有γβα三结构域，与normal-CPP反应生成miltiradiene，在叶中高表达
E. coli	ent-CPP介导的二萜生物合成	IrKSL4	IrKSL4	催化	与ent-CPP反应生成95% ent-atiserene和5% ent-kaurene
E. coli	ent-CPP介导的二萜生物合成	IrKSL5	IrKSL5	催化	与ent-CPP反应生成ent-kaurene
E. coli	normal-CPP介导的二萜生物合成	IrKSL6	IrKSL6	催化	具有γβα三结构域，与normal-CPP反应生成isopimaradiene
Saccharomyces cerevisiae YJ26	miltiradiene氧化途径（铁锈醇生物合成）	CYP76AH30	CYP76AH30	催化	催化miltiradiene羟基化生成ferruginol，在根周皮中与miltiradiene共同检出

关键发现

转录组测序获得27,248,946条reads，组装出60,483条contigs（平均长度886 bp）
鉴定出5个CPS和6个KSL基因共11个二萜合酶基因
IrCPS4和IrCPS5产生ent-CPP，IrCPS1和IrCPS2产生normal-CPP
IrKSL4与ent-CPP反应产生95% ent-atiserene和5% ent-kaurene
IrKSL5产生ent-kaurene，IrKSL2产生ent-异海松二烯样化合物
IrKSL1/IrKSL3与normal-CPP生成miltiradiene，IrKSL6与normal-CPP生成isopimaradiene
在根周皮中检测到miltiradiene、abietatriene和ferruginol
oridonin在叶片中含量高达干重的0.25%
CYP76AH30与CYP76AH1氨基酸序列一致性为80.5%，与CYP76AH22-24一致性为76.1%-77.6%
酵母菌株YJ26中表达CYP76AH30后检测到ferruginol。

研究结论

本研究系统鉴定了碎米桠中11个二萜合酶基因的功能，其中IrCPS4和IrKSL5等参与ent-kaurene二萜（如oridonin）生物合成，IrCPS1/IrCPS2与IrKSL1/IrKSL3催化normal-CPP合成miltiradiene，并进一步由CYP76AH30氧化为ferruginol；IrKSL6生成isopimaradiene。三结构域KSL（IrKSL3、IrKSL6）与双结构域KSL（IrKSL1）的共存揭示了唇形科KSL结构域缺失的进化中间步骤，为理解二萜化学多样性及其演化提供了新视角。