A single oxidosqualene cyclase produces the seco-triterpenoid α-onocerin
- 作者
- Aldo Almeida, Lemeng Dong, Bekzod Khakimov, Jean-Etienne Bassard, Tessa Moses, Frederic Lota, Alain Goossens, Giovanni Appendino, Søren Bak
- 单位
- Department of Plant and Environmental Science, University of Copenhagen, Thorvaldsensvej 40, DK-1871 Frederiksberg C, Denmark; Department of Food Science, University of Copenhagen, Rolighedsvej 16, DK-1958 Frederiksberg C, Denmark; Ghent University, Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Technologiepark 927, 9052 Ghent, Belgium; VIB Center for Plant Systems Biology, Technologiepark 927, 9052 Ghent, Belgium; Dipartimento di Scienze del Farmaco, Università del Piemonte Orientale, Novara, Italy
- 杂志
- Plant Physiology（2017）
- DOI
- 10.1104/pp.17.01369
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明仅存在于亲缘关系很远的石松属和芒柄花属植物中的8,14-断环三萜α-onocerin在Ononis spinosa中的生物合成机制，特别是鉴定催化其环化的酶及与角鲨烯环氧酶的互作关系。
研究策略
通过转录组分析发掘候选OSC和SQE基因；利用本氏烟草瞬时表达和erg7敲除酵母GIL77异源表达验证功能；通过系统发育分析、同源建模与分子对接、荧光寿命成像(FLIM)和RT-qPCR研究进化关系、催化机制和蛋白互作。
核心内容
该研究阐明了刺芒柄花中8,14-断环三萜α-onocerin的生物合成机制。通过转录组分析发掘候选氧化角鲨烯环化酶和角鲨烯环氧酶基因，利用本氏烟草瞬时表达和erg7敲除酵母异源表达验证功能，结合系统发育分析、同源建模与分子对接、荧光寿命成像和RT-qPCR研究催化机制与蛋白互作。结果发现，单个环化酶OsONS1即可从角鲨烯-2,3;22,23-二氧化物合成α-onocerin，与石松中需两个环化酶分步催化不同，表明该途径为趋同进化。OsONS1与OsSQE1共表达使产量提高近20倍，与OsSQE2共表达提高7.5倍；荧光寿命成像证实OsONS1与两种角鲨烯环氧酶均存在特异互作，且与OsSQE2互作更强。分子对接显示底物与催化残基D482结合能为-11.84 kcal/mol。转录分析表明OsSQE2可能是体内主要互作伴侣。该研究揭示了单酶催化断环三萜合成的全新机制，为异源生产α-onocerin提供了关键基因资源。
创新点
首次证明Ononis spinosa中单个氧化角鲨烯环化酶OsONS1即可从角鲨烯-2,3;22,23-二氧化物合成α-onocerin，不同于Lycopodium clavatum需LcLCC和LcLCD两个环化酶分步催化；揭示α-onocerin通路在两种植物中趋同进化；发现OsONS1与OsSQE1/OsSQE2发生特异蛋白-蛋白互作，且OsSQE可显著提高α-onocerin产量。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ononis spinosa | α-onocerin（8,14-断环三萜）生物合成 | OsONS1 | OsONS1 | 催化 | 氧化角鲨烯环化酶；可将角鲨烯-2,3;22,23-二氧化物(SDO)环化为α-onocerin；与OsSQE1共表达产量提升约20倍。 |
| Ononis spinosa | α-onocerin（8,14-断环三萜）生物合成 | OsONS2 | OsONS2 | 催化 | 与OsONS1高度相似，存在SNP差异；单独表达产痕量α-onocerin，与OsSQE2共表达产量提高4.3倍。 |
| Ononis spinosa | 三萜/甾醇前体合成 | OsSQE1 | OsSQE1 | 催化 | 角鲨烯环氧酶，催化角鲨烯生成SDO；与OsONS1共表达使α-onocerin产量提高近20倍，并与OsONS1存在蛋白互作。 |
| Ononis spinosa | 三萜/甾醇前体合成 | OsSQE2 | OsSQE2 | 催化 | 角鲨烯环氧酶；与OsONS1/OsONS2共表达分别提高α-onocerin产量7.5/4.3倍；FLIM显示与OsONS1互作强于OsSQE1，且转录水平与OsONSs共表达。 |
| Lycopodium clavatum | α-onocerin生物合成 | LcLCC | LcLCC | 催化 | 将SDO环化为双环pre-α-onocerin；需与LcLCD共同表达才能在烟草中产生α-onocerin。 |
| Lycopodium clavatum | α-onocerin生物合成 | LcLCD | LcLCD | 催化 | 将pre-α-onocerin环化为α-onocerin；与LcLCC及OsSQE共表达时产量比OsONS1+OsSQE1组合低3倍。 |
| Saccharomyces cerevisiae GIL77 | α-onocerin生物合成 | OsONS1 | OsONS1 | 催化 | GIL77为lanosterol synthase (erg7)敲除菌株，积累SDO；表达OsONS1验证了α-onocerin的产生。 |
关键发现
- α-onocerin仅在Ononis spinosa根部积累
- 水培根中25天时含量为0.0019±0.0003 ng/mg鲜重，35天为0.099±0.018 ng/mg，45天达峰0.45±0.04 ng/mg
- 土培根35天约0.18±0.07 ng/mg，45天为0.56±0.19 ng/mg。毛状根Ohry1和Ohry2产量分别为0.007±0.002和0.029±0.004 ng/mg鲜重，后者比45天水培根低约15倍。OsONS1和OsONS2单独表达仅产痕量α-onocerin（0.0007±0.0001和0.0009±0.0001 ng/mg鲜重）
- 与OsSQE2共表达分别提高7.5倍和4.3倍，与OsSQE1共表达使OsONS1产量提高近20倍，且比OsONS1+OsSQE2组合高约2.5倍。L. clavatum的LcLCC/LcLCD必须同时表达才在烟草中产生α-onocerin，且产量比OsONS1+OsSQE1组合低3倍。OsONS1在GIL77酵母菌株中表达可产生α-onocerin。分子对接显示pre-α-onocerin与催化残基D482的结合能分别为-11.84 kcal/mol（羟基端）和-2.32 kcal/mol（环氧端）。FLIM显示OsONS1与OsSQE1和OsSQE2均存在特异互作，且与OsSQE2的互作更强
- RT-qPCR表明OsSQE1转录本在根中比OsSQE2低三个数量级，OsSQE2从根基部到叶片下降72倍，OsONSs从根基部到叶片下降约1400倍。
研究结论
在Ononis spinosa中，单个OSC OsONS1即可利用角鲨烯-2,3;22,23-二氧化物合成α-onocerin，与Lycopodium clavatum的双环化酶体系不同，表明α-onocerin途径为趋同进化。OsSQE1和OsSQE2通过与OsONS1互作并提高SDO供给来增强α-onocerin产量；转录共表达及FLIM数据提示OsSQE2可能是OsONS1在体内的主要互作伴侣。