De novo transcriptome analysis of Dysoxylum binectariiferum to unravel the biosynthesis of pharmaceutically relevant specialized metabolites
- 作者
- Patel Mohana Kumara, Eranna Varun, Joshi Renuka Sanjay, Anchedoddi Hanumegowda Madhushree, Ramesha Thimmappa
- 单位
- Department of Biotechnology and Crop Improvement, Kittur Rani Chennamma College of Horticulture, Arabhavi, University of Horticultural Sciences, Bagalkot, Karnataka, India; Center for Ayurveda Biology and Holistic Nutrition, The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology (TDU), Bengaluru, Karnataka, India; Amity Institute of Genome Engineering, Amity University Uttar Pradesh, Noida, India
- 杂志
- Frontiers in Plant Science（2023）
- DOI
- 10.3389/fpls.2023.1098987
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析濒危药用植物 Dysoxylum binectariiferum 中抗癌先导化合物 rohitukine（色酮生物碱）及其衍生物的未知生物合成途径，鉴定参与其骨架构建的关键酶和候选基因。
研究策略
对一年生 D. binectariiferum 幼苗的叶片和根组织进行 Illumina NovaSeq 转录组测序，通过 Trinity 进行 de novo 组装，利用 CD-HIT 去冗余获得非冗余蛋白序列，并借助 Nr、Swiss-Prot、KEGG 等数据库进行功能注释；结合 DESeq2 差异表达分析、HPLC 定量 rohitukine、GC-MS 挥发性成分分析以及 qRT-PCR 验证，从转录组中筛选参与rohitukine及萜类、黄酮类等次生代谢途径的候选基因，并构建推测的生物合成路径。
核心内容
本研究对濒危药用植物 Dysoxylum binectariiferum 一年生幼苗的叶片和根组织进行 Illumina NovaSeq 转录组测序，经 Trinity 从头组装获得 126,788 条 unigenes（N50 为 1560 bp，BUSCO 完整度 92.1%），去冗余后翻译出 51,598 条非冗余蛋白序列。功能注释覆盖 Nr、KEGG 等数据库，共鉴定 6,495 个差异表达基因，其中 736 个参与 17 个次生代谢途径。HPLC 定量显示根中 rohitukine 含量为 2.15±0.62%（干重），略高于叶中的 1.89±0.69%。研究重点鉴定了 4 个 CHS/PKS-III 候选基因，其中 PKS1 和 PKS2 在根中高表达，与 rohitukine 积累趋势一致；同时注释到赖氨酸脱羧酶、伯胺氧化酶等哌啶途径酶类。据此提出 rohitukine 可能由 PKS-III 催化合成的 noreugenin 色酮骨架与赖氨酸降解来源的哌啶环收敛装配而成，而非经典黄酮途径。该转录组资源为后续功能验证及利用代谢工程可持续生产 rohitukine 及其抗癌衍生物奠定了基础。
创新点
['首次报道 D. binectariiferum 的 de novo 转录组，组装质量高（N50 1560 bp，BUSCO完整度92.1%），为后续功能基因组学研究提供了重要资源。', '鉴定了4个CHS/PKS-III候选基因（其中3个为非CHS型PKS-III），并结合系统发育和表达分析提出它们可能参与rohitukine色酮骨架（noreugenin）的生物合成，指出聚酮合酶路线比经典的黄酮途径更为可能。', '整合转录组和代谢物数据，发现赖氨酸降解途径（哌啶途径）相关酶在叶片中表达，提出rohitukine由noreugenin与哌啶环收敛装配的假说，填补了色酮生物碱生物合成途径的空白。', '揭示了根/叶组织特异表达模式与rohitukine积累的关联（根中含量略高），并锁定多个在根中高表达的上游苯丙烷途径酶（PAL、C4H、4CL、CHI）和PKS候选基因。']
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Dysoxylum binectariiferum | 苯丙烷/黄酮生物合成 | PAL | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | 催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，黄酮/苯丙烷途径的入口酶，根中高表达 |
| Dysoxylum binectariiferum | 苯丙烷/黄酮生物合成 | C4H | 反式肉桂酸4-羟化酶 | 催化 | 催化肉桂酸对位羟化生成p-香豆酸，细胞色素P450单加氧酶 |
| Dysoxylum binectariiferum | 苯丙烷/黄酮生物合成 | 4CL | 4-香豆酸-CoA连接酶 | 催化 | 催化p-香豆酸生成p-香豆酰-CoA，为黄酮/色酮提供前体 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮/色酮生物合成 | CHS | 查尔酮合酶 | 催化 | 催化4-香豆酰-CoA与丙二酰-CoA缩合生成柚皮素查尔酮，也参与noreugenin合成；unigene DN149243 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮/色酮生物合成 | PKS1 | Ⅲ型聚酮合酶1 | 催化 | 非CHS型PKS-III候选，unigene DN1192，根中高表达，可能参与noreugenin（pentaketide chromone）合成 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮/色酮生物合成 | PKS2 | Ⅲ型聚酮合酶2 | 催化 | 非CHS型PKS-III候选，unigene DN4064，根中高表达，可能参与色酮骨架构建 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮/色酮生物合成 | PKS3 | Ⅲ型聚酮合酶3 | 催化 | 非CHS型PKS-III候选，unigene DN567668，与已知PKS-III聚为一簇，功能待验证 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮生物合成 | CHI | 查尔酮异构酶 | 催化 | 将柚皮素查尔酮异构化为柚皮素，黄酮途径关键酶；根中表达高于叶 |
| Dysoxylum binectariiferum | 哌啶/赖氨酸降解途径 | ldcC/cadA | 赖氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化L-赖氨酸脱羧生成尸胺（cadaverine），为哌啶环提供氮源前体 |
| Dysoxylum binectariiferum | 哌啶/赖氨酸降解途径 | AOC3/AOC2/tynA | 伯胺氧化酶 | 催化 | 将尸胺氧化为5-氨基戊醛，进而形成哌啶环 |
| Dysoxylum binectariiferum | 哌啶/赖氨酸降解途径 | LYS1 | 赖氨酸型酵母氨酸脱氢酶 | 催化 | 参与L-赖氨酸降解和哌啶前体合成 |
| Dysoxylum binectariiferum | 哌啶/赖氨酸降解途径 | AASS | α-氨基己二酸半醛合酶 | 催化 | 参与赖氨酸降解，为哌啶生物合成提供中间体 |
| Dysoxylum binectariiferum | 哌啶/赖氨酸降解途径 | LYS9 | L-谷氨酸型酵母氨酸脱氢酶 | 催化 | 参与赖氨酸降解后续步骤 |
| Dysoxylum binectariiferum | 哌啶/赖氨酸降解途径 | PIPOX | 肌氨酸氧化酶/L-哌啶酸氧化酶 | 催化 | 将L-哌啶酸氧化为己二酸半醛，与吡啶/哌啶生物碱代谢相关 |
| Dysoxylum binectariiferum | 萜类生物合成（MVA途径） | FDPS | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成FPP（C15），倍半萜和三萜共同前体 |
| Dysoxylum binectariiferum | 萜类生物合成（三萜途径） | SQLE | 角鲨烯单加氧酶（角鲨烯环氧酶） | 催化 | 催化角鲨烯氧化生成2,3-氧化鲨烯，三萜和甾醇合成的关键中间体 |
| Dysoxylum binectariiferum | 倍半萜生物合成 | GERD | (-)-大牻牛儿烯D合酶 | 催化 | 催化FPP环化生成大牻牛儿烯D，GC-MS在叶中检测到该产物 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮生物合成（下游） | F3H | 柚皮素3-双加氧酶 | 催化 | 催化柚皮素羟基化生成二氢山柰酚 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮生物合成（下游） | DFR | 二氢黄酮醇4-还原酶/黄烷酮4-还原酶 | 催化 | 催化二氢山柰酚还原生成无色花葵素 |
| Dysoxylum binectariiferum | 黄酮生物合成（下游） | LAR | 无色花青素还原酶 | 催化 | 催化无色花葵素生成(+)-阿夫儿茶素 |
关键发现
- ['测序获得叶片42.43百万条、根38.74百万条双端短读长
- 过滤后分别保留41.52百万（97.85%）和38.09百万（98.33%）clean reads。', 'de novo组装产生274,970条contigs和126,788条unigenes，N50 contig长度为1560 bp
- 去冗余后得到117,619条contigs和51,340条unigenes（N50 1176 bp），并翻译出117,619条蛋白序列，经CD-HIT获得51,598条非冗余蛋白序列（>200 aa）。', 'BUSCO评估显示Eudicots数据集2,326个单拷贝直系同源基因中92.1%完整，表明组装完整性高。', '功能注释：78.88%非冗余序列注释到Nr数据库，92.4%到RefSeq，87.06%到EggNOG，74.22%到Pfam，37.89%到KEGG。', '共鉴定6,495个差异表达基因（DEGs），其中3,532个在根中上调，2,963个在叶中上调
- 736个DEGs参与17个次生代谢途径。', 'HPLC定量显示：根中rohitukine含量为2.15±0.62%（干重），叶中为1.89±0.69%（p>0.05，差异不显著）。', 'GC-MS检测到叶中单萜占14%、倍半萜占6.5%、酮类1.5%
- 根中倍半萜占49.75%、倍半萜类8.86%
- 并检测到α-、β-蒎烯，石竹烯，大牻牛儿烯D，α-古芸烯等。', '在转录组中鉴定了12个黄酮途径关键酶（44个unigenes），包括CHS（6）、CHI（2）、PAL（3）、C4H（5）、4CL（22）、F3H（1）、DFR（3）、LAR（4）、ANS（1）、ANR（1）等。', '发现4个CHS/PKS-III全长候选基因（DN149243对应CHS
- DN1192/PKS1、DN4064/PKS2、DN567668为PKS-III），其中PKS1和PKS2在根中高表达，与rohitukine积累水平相对应。', '赖氨酸/哌啶途径相关酶：lysine decarboxylase（13 unigenes）、primary amine oxidase（24）、LYS1（2）、AASS（5）、LYS9（3）、PIPOX（2）等均在转录组中存在。', '萜类途径中MVA途径6个关键酶（48 unigenes）、MEP途径8个关键酶（29 unigenes），以及FDPS（4）、SQLE（9）、GERD（6）等被注释。']
研究结论
该研究通过de novo转录组分析构建了D. binectariiferum叶片和根的全面基因表达图谱，为解析rohitukine等药用次生代谢物的生物合成提供了关键候选基因和通路蓝图。研究提出rohitukine的生物合成可能涉及noreugenin（由PKS-III催化合成）与哌啶环（来自赖氨酸降解途径）的收敛，且根中高表达的PKS1/PKS2等候选基因与rohitukine积累趋势一致。该转录组资源及候选基因的鉴定为后续功能验证、异源表达和代谢工程改造以可持续生产rohitukine及其抗癌衍生物（flavopiridol、P-276-00）奠定了重要基础。