A Dedicated Type II NADPH Dehydrogenase Performs the Penultimate Step in the Biosynthesis of Vitamin K1 in Synechocystis and Arabidopsis
- 作者
- Abdelhak Fatihi, Scott Latimer, Stefan Schmollinger, Anna Block, Patrick H. Dussault, Wim F.J. Vermaas, Sabeeha S. Merchant, Gilles J. Basset
- 单位
- Department of Agronomy and Horticulture, and Center for Plant Science Innovation, University of Nebraska, Lincoln, Nebraska 68588; Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, California 90095; Department of Chemistry, University of Nebraska, Lincoln, Nebraska 68588; School of Life Sciences and Center for the Study of Early Events in Photosynthesis, Arizona State University, Tempe, Arizona 85287; Institute for Genomics and Proteomics, University of California, Los Angeles, California 90095
- 杂志
- The Plant Cell（2015）
- DOI
- 10.1105/tpc.15.00103
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明拟南芥NDC1和集胞藻ndbB缺失导致脱甲基叶绿醌积累而不产生叶绿醌的分子机制，确定维生素K1生物合成中是否存在由II型NAD(P)H脱氢酶催化的脱甲基萘醌环还原步骤。
研究策略
综合运用基因共表达分析、比较基因组学、反向遗传学（拟南芥和集胞藻突变体）、化学机理建模、体外酶活性测定与动力学分析等策略，鉴定维生素K1生物合成途径中由II型NAD(P)H脱氢酶（NDC1/ndbB）催化的脱甲基萘醌环还原步骤，并揭示其与脱甲基萘醌甲基转移酶的偶联机制。
核心内容
该研究通过组合共表达分析、比较基因组学、反向遗传学和酶学手段，揭示了维生素K1生物合成中一个此前未知的关键步骤。研究在拟南芥和集胞藻中证实，II型NAD(P)H脱氢酶NDC1/ndbB负责将脱甲基萘醌环还原为醌醇形式，该还原反应是脱甲基萘醌甲基转移酶MenG进行AdoMet依赖性甲基化的严格前提。NDC1以甲萘醌为底物时Km为20 μM，催化效率2.2×10⁴ M⁻¹s⁻¹，而集胞藻ndbB的催化效率高出约60倍，两者均受双香豆素抑制。集胞藻ΔndbB突变体仅积累微量叶绿醌而大量积累脱甲基叶绿醌，与menG突变体表型一致。高光处理下ndc1拟南芥叶绿素a和b分别比野生型低19%和16%，光系统II效率显著下降。该发现将维生素K1合成途径中的环还原步骤明确为倒数第二步，并证明NDC1/ndbB在植物和蓝细菌中功能保守，为理解光合生物中该途径的代谢区室化提供了新视角。
创新点
首次揭示维生素K1生物合成中存在由II型NAD(P)H脱氢酶催化的脱甲基萘醌环还原步骤；利用化学模型和酶学实验证明甲基化严格依赖还原型醌醇底物；通过共表达和比较基因组学发现NDC1/ndbB与维生素K合成基因的保守功能关联；为理解植物和蓝细菌维生素K1合成途径的代谢区室化提供了新视角。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 拟南芥 (Arabidopsis thaliana) | 维生素K1（叶绿醌）生物合成 | NDC1 (At5g08740) | NDC1 (type II NAD(P)H dehydrogenase C1) | 催化 | 质体定位，催化脱甲基叶绿醌还原为脱甲基叶绿醌醇，是甲基化的前提 |
| 拟南芥 | 维生素K1生物合成 | MENG (At1g23360) | 脱甲基萘醌甲基转移酶 (MenG) | 催化 | 催化AdoMet依赖的脱甲基萘醌甲基化，生成叶绿醌；严格需要还原型醌醇底物 |
| 集胞藻 (Synechocystis sp. PCC 6803) | 叶绿醌/维生素K1生物合成 | ndbB (slr1743) | NdbB | 催化 | NDC1的功能同源物；缺失导致脱甲基叶绿醌积累 |
| 集胞藻 | 叶绿醌生物合成 | ndbA (slr0851) | NdbA | 催化 | II型NAD(P)H脱氢酶；缺失不影响叶绿醌合成，作为对照 |
| 集胞藻 | 叶绿醌生物合成 | ndbC (slr1484) | NdbC | 催化 | II型NAD(P)H脱氢酶；缺失不影响叶绿醌合成 |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) | 甲萘醌/维生素K2生物合成 | menG | MenG | 催化 | 异源表达的脱甲基萘醌甲基转移酶，用于体外实验 |
关键发现
- 共表达分析显示拟南芥NDC1与MENG共享超过50%的top500共表达基因（水稻为54%），而NDC1与VTE1仅共享30%（水稻11%）
- 集胞藻ΔndbB和ΔΔndbABC菌株仅积累微量叶绿醌而大量积累脱甲基叶绿醌，与menG突变体类似，而ΔndbA和ΔndbC正常
- 体外甲基转移实验证明DTT存在时MenG才合成叶绿醌，说明还原型底物是必需
- NDC1催化脱甲基叶绿醌还原，需FAD，预孵育FAD使活性提高约25倍
- NDC1以甲萘醌为底物Km=20 μM、Kcat=0.44 s⁻¹、催化效率2.2×10⁴ M⁻¹s⁻¹，受双香豆素抑制Ki=5.5 μM；ndbB对应值Km=2.4 μM、Kcat=3.2 s⁻¹、催化效率133.3×10⁴ M⁻¹s⁻¹、Ki=1.3 μM
- 高光处理下ndc1拟南芥叶绿素a和b分别比野生型低19%和16%，ΦPSII从0.321降至0.212
- 脱甲基萘醌醇自氧化半衰期约1.5 h。
研究结论
维生素K1生物合成途径包含一个先前的未知步骤：脱甲基萘醌环必须首先被II型NAD(P)H脱氢酶（NDC1/ndbB）还原为醌醇形式，才能作为脱甲基萘醌甲基转移酶的底物进行AdoMet依赖性甲基化。该还原步骤是维生素K1生物合成的倒数第二步，且该酶在植物和蓝细菌中保守，并在细菌的甲萘醌合成基因簇中也有广泛存在。