Modularity of Plant Metabolic Gene Clusters: A Trio of Linked Genes That Are Collectively Required for Acylation of Triterpenes in Oat
- 作者
- Sam T. Mugford, Thomas Louveau, Rachel Melton, Xiaoquan Qi, Saleha Bakht, Lionel Hill, Tetsu Tsurushima, Suvi Honkanen, Susan J. Rosser, George P. Lomonossoff, Anne Osbourn
- 单位
- John Innes Centre, Norwich NR4 7UH, United Kingdom; Faculty of Business, Hannan University, Matsubara City, Osaka 580, Japan; Institute of Molecular Cell and Systems Biology, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, United Kingdom
- 杂志
- The Plant Cell（2013）
- DOI
- 10.1105/tpc.113.110551
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明燕麦avenaicin生物合成基因簇中三个相邻基因（Sad9/MT1、Sad10/UGT74H5、Sad7/SCPL1）如何共同负责avenaicin的C-21位酰化修饰，并揭示其模块化组织与亚细胞定位。
研究策略
利用遗传学（sad9突变体鉴定）、生物化学（重组MT1酶动力学）、异源共表达（N. benthamiana中的CPMV表达系统）和免疫金标电镜定位等方法，证明三个相邻基因构成一个功能模块。
核心内容
该研究以燕麦avenaicin生物合成基因簇为对象，解析了三个相邻基因Sad9（MT1）、Sad10（UGT74H5）和Sad7（SCPL1）共同完成三萜C-21位酰化修饰的模块化机制。通过突变体鉴定、重组酶动力学、本氏烟异源共表达及免疫金标定位等手段，研究证明MT1催化邻氨基苯甲酸N-甲基化（Km=5.51 μM），UGT74H5将产物转化为葡萄糖酯，SCPL1最终完成酰基转移。sad9突变体中脱甲基avenaicin A-1积累量达189.2 pmol/mg鲜重，而野生型avenaicin A-1为365.3 pmol/mg鲜重，且突变体对禾顶囊壳菌更易感，去酰化产物无抗真菌活性。在烟草中共表达MT1和UGT74H5可积累N-甲基邻氨基苯甲酰-O-葡萄糖（39.8 nmol/mg鲜重），验证了级联反应的前两步。研究首次在植物代谢基因簇中揭示功能模块化组织，提出三萜生物合成的亚细胞区室化模型，为三萜类化合物的代谢工程改造提供了可移植的功能模块。
创新点
首次在植物代谢基因簇中揭示功能模块化（三个相邻基因共同完成一类化学修饰）；完整解析了avenaicin C-21酰化所需的甲基转移酶-糖基转移酶-酰基转移酶级联反应；提出三萜生物合成亚细胞区室化模型。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Avena strigosa | avenaicin生物合成（三萜类） | Sad9 | MT1 | 催化 | 邻氨基苯甲酸N-甲基转移酶，将邻氨基苯甲酸甲基化为N-甲基邻氨基苯甲酸，定位于细胞质 |
| Avena strigosa | avenaicin生物合成（三萜类） | Sad10 | UGT74H5 | 催化 | 家族1糖基转移酶，将N-甲基邻氨基苯甲酸糖基化为N-甲基邻氨基苯甲酰-O-葡萄糖，定位于细胞质 |
| Avena strigosa | avenaicin生物合成（三萜类） | Sad7 | SCPL1 | 催化 | 丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶，将N-甲基邻氨基苯甲酰基转移到三萜骨架C-21位，定位于液泡 |
| Avena strigosa | avenaicin生物合成（三萜类） | Sad1 | β-amyrin合酶 (AsβAS1) | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化为β-amyrin，是avenaicin三萜骨架合成的第一步 |
| Avena strigosa | avenaicin生物合成（三萜类） | Sad2 | CYP51H10 | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，参与三萜骨架的氧化修饰 |
| Nicotiana benthamiana | 异源共表达（avenaicin酰化模块） | Sad9, Sad10, Sad7 | MT1, UGT74H5, SCPL1 | 催化 | 利用CPMV表达系统瞬时共表达，验证三基因模块功能，共表达MT1和UGT74H5可产生N-甲基邻氨基苯甲酰-O-葡萄糖 |
关键发现
- MT1（Sad9）编码邻氨基苯甲酸N-甲基转移酶，Km=5.51±0.11 μM，Kcat/Km=5.55±0.16 nM⁻¹s⁻¹，最适pH 8.0
- sad9突变体中des-methyl avenacin A-1（DMA）积累量为109.0±29.9 pmol/mg鲜重（#961）和189.2±26.5 pmol/mg鲜重（#1310），而野生型avenaicin A-1为365.3±8.9 pmol/mg鲜重
- 在N. benthamiana中共表达MT1和UGT74H5可积累N-甲基邻氨基苯甲酰-O-葡萄糖（39.8±6.5 nmol/mg鲜重）
- sad9突变体对禾顶囊壳菌（G. graminis var tritici）更易感
- 去酰化avenaicin无抗真菌活性
- SCPL1蛋白水平在早期途径突变体（sad1、sad2）中显著降低。
研究结论
Sad9（MT1）、Sad10（UGT74H5）和Sad7（SCPL1）三个相邻基因构成avenaicin酰化功能模块，分别催化邻氨基苯甲酸的N-甲基化、葡萄糖酯化和酰基转移；该模块可应用于三萜类化合物的代谢工程改造，C-21酰基对avenaicin的生物活性至关重要。