Molecular Structure and Enzymatic Function of Lycopene Cyclase from the Cyanobacterium Synechococcus sp Strain PCC7942
- 作者
- Francis X. Cunningham, Jr., Zairen Sun, Daniel Chamovitz, Joseph Hirschberg, Elisabeth Gantt
- 单位
- Department of Botany, University of Maryland, College Park, Maryland 20742; Maryland Agricultural Experiment Station, College Park, Maryland 20742; Department of Genetics, The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem 91904, Israel
- 杂志
- The Plant Cell（1994）
- DOI
- 10.1105/tpc.6.8.1107
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从光合生物中克隆编码番茄红素环化酶的基因，并解析其分子结构与酶学功能，以阐明β-胡萝卜素生物合成中环化步骤的分子机制
研究策略
利用遗传互补定位克隆蓝藻Synechococcus sp PCC7942的番茄红素环化酶基因crtL，在大肠杆菌异源表达系统中通过底物工程（积累番茄红素、神经孢烯、ζ-胡萝卜素）验证酶的底物特异性，并结合除草剂MPTA抗性突变分析启动子调控
核心内容
该研究从蓝藻Synechococcus sp PCC7942中克隆了编码番茄红素环化酶的crtL基因，并在大肠杆菌异源表达系统中解析了其分子结构与酶学功能。通过底物工程策略，研究者在大肠杆菌中分别积累番茄红素、神经孢烯和ζ-胡萝卜素，验证了该酶的底物特异性。结果显示，crtL编码一个含411个氨基酸、分子量46,125 Da的多肽，可同时催化番茄红素转化为β-胡萝卜素以及神经孢烯转化为β-玉米胡萝卜素，但ζ-胡萝卜素不能被环化。除草剂MPTA抑制实验表明，40 μM MPTA可有效抑制番茄红素和神经孢烯的环化，却对ζ-胡萝卜素无影响，说明该酶要求底物具备7-8或7'-8'双键。对MPTA抗性突变体的分析鉴定出起始密码子上游106 bp处的C到T点突变，该突变导致基因过表达，使突变体可耐受超过100 μM MPTA而野生型在2 μM下即无法生长。氨基酸序列比对显示，该蓝藻酶与Erwinia细菌型番茄红素环化酶的一致性仅为22-23%，且含有FAD结合基序，提示其可能是一种黄素酶。这项工作首次从光合生物中克隆了番茄红素环化酶基因，并揭示了蓝藻/植物型与细菌型环化酶在进化上独立起源，为理解类胡萝卜素生物合成途径的分子机制奠定了基础。
创新点
首次从光合生物中克隆并测序番茄红素环化酶基因crtL；证明单一基因产物即可催化番茄红素和神经孢烯的环化；鉴定MPTA抗性突变为启动子区域的点突变；发现该酶含有FAD结合基序
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechococcus sp strain PCC7942 | 类胡萝卜素生物合成 | crtL | lycopene cyclase | 催化 | 首次从光合生物中克隆的番茄红素环化酶基因，产物催化番茄红素生成β-胡萝卜素，亦能环化神经孢烯生成β-玉米胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtL | lycopene cyclase | 催化 | 异源表达Synechococcus crtL基因，验证底物特异性：番茄红素和神经孢烯可被环化，ζ-胡萝卜素不能 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtP | phytoene desaturase | 催化 | 来自Synechococcus的八氢番茄红素脱饱和酶，用于构建积累ζ-胡萝卜素的工程菌株 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI (Rhodobacter capsulatus) | phytoene desaturase | 催化 | 来自荚膜红细菌的八氢番茄红素脱饱和酶，用于构建积累神经孢烯的工程菌株 |
关键发现
- crtL基因编码411个氨基酸的多肽，分子量为46,125 Da，等电点pI为6.0
- MPTA抗性突变MPTA'-5是起始密码子上游106 bp处的C到T点突变
- MPTA在40 μM浓度下可有效抑制番茄红素和神经孢烯的环化，但ζ-胡萝卜素不受影响
- 表达crtL的大肠杆菌中，番茄红素转化为β-胡萝卜素，神经孢烯转化为β-玉米胡萝卜素，ζ-胡萝卜素不能被环化
- Synechococcus lycopene cyclase与Erwinia的lycopene cyclase氨基酸序列一致性仅为22-23%
- 野生型Synechococcus在2 μM MPTA浓度下不能生长，而突变体可耐受超过100 μM MPTA
研究结论
crtL编码的番茄红素环化酶是光合生物β-胡萝卜素生物合成中的关键酶，催化番茄红素和神经孢烯的环化，且要求底物具有7-8或7'-8'双键；该酶含有FAD结合基序，可能是一种黄素酶；MPTA抗性源于启动子突变导致的基因过表达；蓝藻/植物型番茄红素环化酶与细菌型酶序列相似性极低，提示该代谢途径在进化上独立起源