Rational design of enantioselective enzymes requires considerations of entropy
- 作者
- JENNY OTTOSSON, JOHANNA C. ROTTICCI-MULDER, DIDIER ROTTICCI, KARL HULT
- 单位
- Department of Biotechnology, Royal Institute of Technology
- 杂志
- Protein Science（2001）
- DOI
- 10.1110/ps.13501
- 所属领域
- 酶工程/蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
理性设计对映选择性酶时通常忽略熵贡献，导致模型不完整，无法准确预测突变对酶对映选择性的影响。
研究策略
研究Candida antarctica lipase B及其五个突变体（T103G、W104H、S47A、T42V、T42VS47A）催化3-甲基-2-丁醇动力学拆分的温度依赖性，通过对映体比率E的线性关系分解出微分活化焓变（ΔR-SΔH‡）和熵变（ΔR-SΔS‡），比较各突变体的热力学参数变化。
核心内容
该研究以Candida antarctica脂肪酶B及其五个突变体为对象，通过测量其催化3-甲基-2-丁醇动力学拆分的温度依赖性，将对映体比率E分解为微分活化焓变和熵变，系统考察了突变对酶对映选择性的热力学来源。结果显示，野生型在296 K下E值为970，T103G突变体E值升至2140，而W104H突变体E值骤降至150。值得注意的是，W104H的微分活化焓变虽比野生型更有利，但其熵变的不利贡献远超焓的增益，导致对映选择性大幅下降。所有突变体均表现出显著的熵贡献，且焓熵补偿关系并不完全，如T103G的焓变增加10.9 kJ/mol时熵变仅增加8.9 kJ/mol，部分补偿反而提升了E值。该工作证明熵在对映选择性理性设计中与焓同等重要，仅基于焓的分子建模可能错误预测突变效果，为酶催化模型纳入熵项提供了直接实验依据。
创新点
证明了熵在酶对映选择性理性设计中与焓同等重要；揭示突变引起的焓熵补偿是不完全的，因此可以通过突变调节对映选择性；指出仅基于焓的分子建模会错误预测对映选择性（如W104H）。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris | 脂肪酶催化仲醇动力学拆分（3-甲基-2-丁醇与丁酸乙烯酯/辛酸乙烯酯转酯反应） | CALB（野生型） | Candida antarctica lipase B（CALB） | 催化 | 催化3-甲基-2-丁醇对映选择性转酯，296K下E=970 |
| Pichia pastoris | 脂肪酶催化仲醇动力学拆分（3-甲基-2-丁醇与丁酸乙烯酯/辛酸乙烯酯转酯反应） | CALB T103G | CALB突变体T103G | 催化 | 引入G-X-S-X-G共识序列，E提高至2140，热稳定性增加 |
| Pichia pastoris | 脂肪酶催化仲醇动力学拆分（3-甲基-2-丁醇与丁酸乙烯酯/辛酸乙烯酯转酯反应） | CALB W104H | CALB突变体W104H | 催化 | 活性位点立体特异性口袋边界残基突变，E降至150，ΔR-SΔH‡和ΔR-SΔS‡绝对值均显著增大 |
| Pichia pastoris | 脂肪酶催化仲醇动力学拆分（3-甲基-2-丁醇与丁酸乙烯酯/辛酸乙烯酯转酯反应） | CALB S47A | CALB突变体S47A | 催化 | E降至340，主要由于ΔR-SΔH‡绝对值减小 |
| Pichia pastoris | 脂肪酶催化仲醇动力学拆分（3-甲基-2-丁醇与丁酸乙烯酯/辛酸乙烯酯转酯反应） | CALB T42V | CALB突变体T42V | 催化 | E降至520，但ΔR-SΔH‡和ΔR-SΔS‡绝对值变化最大（相对野生型+4.1和+2.6 kJ/mol） |
| Pichia pastoris | 脂肪酶催化仲醇动力学拆分（3-甲基-2-丁醇与丁酸乙烯酯/辛酸乙烯酯转酯反应） | CALB T42VS47A | CALB双突变体T42VS47A | 催化 | E降至390，热力学参数与S47A相似，显示突变效应非简单叠加 |
关键发现
在296 K下，野生型E=970，T103G突变体E=2140（增加），W104H突变体E=150（大幅下降），T42V E=520，S47A E=340，T42VS47A E=390。ΔR-SΔH‡（kJ/mol）分别为：野生型-20.8±0.9，T103G -31.7±0.1，W104H -44.7±1.0，T42V -16.7±0.9，S47A -18.3±0.7，T42VS47A -18.1±0.4。ΔR-SΔS‡（kJ/mol）分别为：野生型-13.2±3.0，T103G -43.4±0.4，W104H -109.5±3.3，T42V -4.5±2.9，S47A -13.4±2.4，T42VS47A -11.5±1.4。W104H的ΔR-SΔS‡绝对值超过野生型8倍，ΔR-SΔH‡超过2倍，但熵的不利贡献大于焓的有利贡献，导致E降低。T103G突变体焓变增加10.9 kJ/mol，熵变增加8.9 kJ/mol（补偿不完全），E从970升至2140。所有突变体的ΔR-SΔS‡与ΔR-SΔH‡都同等显著，且呈现补偿但非完全补偿关系。
研究结论
酶中即使是微小的变异也会同时影响活化焓和活化熵；对映选择性的熵贡献与焓贡献同等重要。突变引起的焓熵补偿是部分的，因此通过理性设计优化酶对映选择性是可能的，但必须将熵纳入酶催化模型。