高级醇 · 代谢工程文献库

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Improved sake metabolic profile during fermentation due to increased mitochondrial pyruvate dissimilation

作者
Gennaro Agrimi, Maria C. Mena, Kazuki Izumi, Isabella Pisano, Lucrezia Germinario, Hisashi Fukuzaki, Luigi Palmieri, Lars M. Blank, Hiroshi Kitagaki
单位
Department of Biosciences, Biotechnologies and Biopharmaceutics, University of Bari, Via Orabona 4, 70125 Bari, Italy; Department of Environmental Sciences, Faculty of Agriculture, Saga University, 1 Honjo- cho, Saga 840- 8502, Japan; Institute of Applied Microbiology - iAMB, ABB - Aachen Biology and Biotechnology Department, RWTH Aachen University, 52074 Aachen, Germany; Department of Biochemistry and Applied Biosciences, United Graduate School of Agricultural Sciences, Kagoshima University, Korimoto- 21- 24, Kagoshima 890- 8580, Japan
杂志
FEMS Yeast Research（2014）
DOI
10.1111/1567-1364.12120
所属领域
发酵工程
关键词
Metabolic Flux AnalysisYeastbrewer's yeastcell physiology
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解决的核心问题

酿酒酵母在发酵过程中分泌丙酮酸等副产物，导致清酒等酒类产生异味，但丙酮酸积累的调控机制尚不清楚，尤其是线粒体丙酮酸转运对发酵代谢谱的影响。

研究策略

以耐α-反式氰肉桂酸（线粒体丙酮酸转运抑制剂）的清酒酵母突变株TCR7为对象，通过氧电极测氧、13C代谢通量分析、酶活测定及线粒体形态观察，将其与亲本Kyokai no.7和实验室菌株CEN.PK 113-7D进行比较，解析线粒体活性与丙酮酸分泌的关系。

研究路线图

100%
问题：丙酮酸积累影响清酒风味
策略：对比TCR7与亲本等菌株
关键改造：线粒体丙酮酸氧化增强
结果：TCR7丙酮酸分泌降低
结果：线粒体保持网状更持久
结论：调控线粒体活性可改良发酵性能
结果：TCA循环活性高5倍
方法：代谢通量分析+酶活+形态
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核心内容

该研究以线粒体丙酮酸转运抑制剂筛选出的清酒酵母突变株TCR7为对象，通过氧电极测定、13C代谢通量分析、酶活测定及线粒体形态观察，将其与亲本Kyokai no.7及实验室菌株CEN.PK 113-7D比较，探究线粒体丙酮酸氧化增强对丙酮酸分泌和发酵代谢谱的影响。结果显示，TCR7线粒体丙酮酸氧化最大速率达305 nmol O2/(min·mg蛋白)，较亲本高58%，丙酮酸脱氢酶活性约为亲本一半，但TCA循环通量是CEN.PK的5倍。0.5M NaCl胁迫下TCR7甘油产生率为1.7 mmol/g/h，显著低于CEN.PK的3.2 mmol/g/h；静置培养12小时后清酒酵母仍保持线粒体丝状结构，而实验室菌株已碎片化。研究表明线粒体丙酮酸氧化增强可减少丙酮酸分泌，且清酒酵母线粒体代谢活性明显高于实验室菌株，调控线粒体活性有望成为改良酿造酵母发酵性能的新策略。

创新点

首次揭示线粒体丙酮酸氧化增强可降低丙酮酸分泌；发现清酒酵母具有比实验室菌株更高的线粒体代谢活性，并在厌氧转变时保持更长时间的线粒体网状结构；提出调控线粒体活性可作为改良酿造酵母发酵性能的新策略。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae Kyokai no.7 丙酮酸代谢 MPC1, MPC2, MPC3 线粒体丙酮酸载体 转运 亲本清酒酵母，丙酮酸分泌较高；TCR7为其突变体。
Saccharomyces cerevisiae TCR7 丙酮酸代谢 MPC1, MPC2, MPC3 线粒体丙酮酸载体 转运 低丙酮酸分泌突变株，线粒体丙酮酸氧化Vmax比亲本高58%。
Saccharomyces cerevisiae 丙酮酸氧化 — 丙酮酸脱氢酶复合体 催化 TCR7中该酶活性约为Kyokai no.7的一半。
Saccharomyces cerevisiae 呼吸链 NDE1, NDE2, NDI1 NADH脱氢酶 能量供给 参与胞质和线粒体NADH氧化，通量分析显示TCR7的NADH氧化增强。

关键发现

  1. TCR7线粒体丙酮酸氧化Vmax为305 nmol O2/(min·mg蛋白)，比亲本Kyokai no.7高58%
  2. Km为0.38 mM（亲本0.15 mM）
  3. TCR7的丙酮酸脱氢酶活性约为亲本的一半
  4. 13C-代谢通量分析显示TCR7线粒体TCA循环活性是CEN.PK 113-7D的5倍
  5. 无NaCl时K7/TCR7生物量得率0.21±0.01 g/g葡萄糖，CEN.PK为0.14±0.05
  6. 5M NaCl下TCR7甘油产生率为1.7±0.1 mmol/g/h，低于CEN.PK的3.2±0.2
  7. 静置培养12h后清酒酵母仍保持线粒体丝状结构，而实验室菌株BY4743已碎片化。

研究结论

TCR7通过增强线粒体丙酮酸氧化（可能是由于丙酮酸转运增加）从而减少丙酮酸分泌；清酒酵母的线粒体代谢水平显著高于实验室菌株，且其活性与发酵产物谱相关，调控线粒体活性有望成为改善酿造酵母发酵性能的新途径。