A newly identified fatty alcohol oxidase gene is mainly responsible for the oxidation of long chain ω-hydroxy fatty acids in Yarrowia lipolytica
- 作者
- Michael Gatter, André Förster, Kati Bär, Miriam Winter, Christina Otto, Patrick Petzsch, Michaela Ježková, Katrin Bahr, Melanie Pfeiffer, Falk Matthäus, Gerold Barth
- 单位
- Institute of Microbiology, Dresden University of Technology
- 杂志
- FEMS Yeast Research（2014）
- DOI
- 10.1111/1567-1364.12176
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在解脂耶氏酵母中，鉴定主要负责长链ω-羟基脂肪酸氧化为二羧酸的酶（脂肪醇脱氢酶还是脂肪醇氧化酶），以指导ω-羟基脂肪酸的生物技术生产。
研究策略
通过比较序列分析在Yarrowia lipolytica中鉴定出9个潜在醇脱氢酶基因和1个醇氧化酶基因；在β-氧化阻断菌株（ΔPOX1-6）中逐一或组合敲除这些基因，并在摇瓶和发酵罐中评估产物（二羧酸和ω-羟基脂肪酸）积累；同时过表达FAO1基因验证其功能。
核心内容
该研究在解脂耶氏酵母中系统鉴定了催化长链ω-羟基脂肪酸氧化为二羧酸的关键酶。通过序列比对找到9个潜在醇脱氢酶基因和1个醇氧化酶基因，并在β-氧化阻断菌株中逐一或组合敲除。结果显示，单独敲除8个醇脱氢酶基因仅使ω-羟基脂肪酸积累略有增加，而敲除醇氧化酶基因FAO1的菌株H222ΔPΔF在发酵罐中产生约7 g/L ω-羟基十二酸和3 g/L十二碳二酸；同时敲除两类基因的菌株H222ΔPΔAΔF则产生约9 g/L ω-羟基十二酸，二羧酸降至0.3 g/L，表明FAO1是催化该氧化步骤的主要酶。过表达FAO1的菌株H222ΔPoF使十二碳二酸产量提升至约11 g/L，酶活测定也证实FAO1缺失菌株中脂肪醇氧化酶活性消失，而过表达菌株中活性提高十倍以上。该发现明确了脂肪酸醇氧化酶而非醇脱氢酶主导ω-羟基脂肪酸的进一步氧化，为利用解脂耶氏酵母高效生产长链ω-羟基脂肪酸和二羧酸提供了关键的基因操作靶点。
创新点
首次在Yarrowia lipolytica中鉴定并功能验证了脂肪酸醇氧化酶基因FAO1，证明其是长链ω-羟基脂肪酸氧化的主要催化酶；构建了可高效积累ω-羟基脂肪酸的多基因缺失菌株H222ΔPΔAΔF；通过过表达FAO1提高了二羧酸产量。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | FAO1 | Fao1p（脂肪酸醇氧化酶） | 催化 | 催化ω-羟基脂肪酸氧化为脂肪醛，是ω-氧化的主要限速酶；其缺失导致ω-羟基脂肪酸积累 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | FADH | 脂肪酸醇脱氢酶 | 催化 | 可能参与长链醇氧化，但作用次要；在H222ΔPΔA中敲除 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | ADH1 | 醇脱氢酶1 | 催化 | 与C. tropicalis ADH基因相似，参与醇氧化，但作用次要 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | ADH2 | 醇脱氢酶2 | 催化 | 潜在醇脱氢酶，敲除对ω-羟基脂肪酸积累影响小 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | ADH3 | 醇脱氢酶3 | 催化 | 潜在醇脱氢酶，敲除对ω-羟基脂肪酸积累影响小 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | ADH4 | 醇脱氢酶4 | 催化 | 与S. cerevisiae ADH4相似性低，敲除对产物影响小 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | ADH5 | 醇脱氢酶5 | 催化 | 潜在醇脱氢酶，敲除对产物影响小 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | ADH6 | 醇脱氢酶6 | 催化 | 与ADH3相似，敲除对产物影响小 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | ω-氧化途径 | ADH7 | 醇脱氢酶7 | 催化 | 与S. cerevisiae ADH3相似，敲除对产物影响小 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | β-氧化途径 | POX1 | 酰基辅酶A氧化酶1 | 催化 | 敲除所有六个POX基因以阻断β-氧化 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | β-氧化途径 | POX2 | 酰基辅酶A氧化酶2 | 催化 | 敲除所有六个POX基因以阻断β-氧化 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | β-氧化途径 | POX3 | 酰基辅酶A氧化酶3 | 催化 | 敲除所有六个POX基因以阻断β-氧化 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | β-氧化途径 | POX4 | 酰基辅酶A氧化酶4 | 催化 | 敲除所有六个POX基因以阻断β-氧化 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | β-氧化途径 | POX5 | 酰基辅酶A氧化酶5 | 催化 | 敲除所有六个POX基因以阻断β-氧化 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔP (Δpox1-Δpox6) | β-氧化途径 | POX6 | 酰基辅酶A氧化酶6 | 催化 | 敲除所有六个POX基因以阻断β-氧化 |
| Yarrowia lipolytica H222ΔPoF (POX缺失+FAO1过表达) | ω-氧化途径 | FAO1 | Fao1p（脂肪酸醇氧化酶） | 催化 | 在TEF1强启动子控制下过表达，使DDDA产量提高至约11 g/L |
关键发现
在Y. lipolytica H222ΔP（仅敲除POX1-6）中，发酵罐培养4天后产生约6 g/L十二碳二酸（DDDA），几乎不积累ω-羟基十二酸（ω-HDDA）。敲除8个醇脱氢酶基因（FADH, ADH1-7）仅轻微增加ω-羟基脂肪酸积累。敲除FAO1的菌株H222ΔPΔF产生约7 g/L ω-HDDA和3 g/L DDDA。同时敲除ADH和FAO1的菌株H222ΔPΔAΔF产生约9 g/L ω-HDDA和0.3 g/L DDDA。过表达FAO1的菌株H222ΔPoF产生约11 g/L DDDA。摇瓶实验中，H222ΔP的产物比（二羧酸:ω-羟基脂肪酸）为5:1（DDA底物）至259:1（DD底物），而H222ΔPΔF的比值为2:5（DDA）至13:1（HDA）。脂肪醇氧化酶活性在FAO1缺失菌株中消失，在过表达菌株中提高十倍以上（约0.03-0.04 U/mg蛋白）。
研究结论
在Yarrowia lipolytica中，脂肪酸醇氧化酶（FAO1）是催化ω-羟基脂肪酸进一步氧化为二羧酸的主要酶，而脂肪醇脱氢酶（FADH, ADH1-7）仅起次要作用。敲除FAO1可显著积累ω-羟基脂肪酸，过表达FAO1可显著提高二羧酸产量。该发现为利用Y. lipolytica生物技术生产长链ω-羟基脂肪酸和二羧酸奠定了基础。