Functional identification of rice syn-copaly digestion synthase and its role in initiating biosynthesis of diterpenoid phytoalexin/allelopathic natural products
- 作者
- Meimei Xu, Matthew L. Hillwig, Sladjana Prisic, Robert M. Coates, Reuben J. Peters
- 单位
- Department of Biochemistry, Biophysics, and Molecular Biology, Iowa State University, Ames, IA 50011, USA; Department of Chemistry, University of Illinois, Urbana, IL 61801, USA
- 杂志
- The Plant Journal（2004）
- DOI
- 10.1111/j.1365-313X.2004.02137.x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定水稻中催化香叶基香叶基二磷酸（GGPP）环化生成 syn-柯巴基二磷酸（syn-CPP）的II类萜烯合酶（OsCPSsyn），并阐明其在二萜类植保素/化感物质生物合成中的调控作用及序列保守特征。
研究策略
利用水稻基因组和全长cDNA数据库信息，通过BLAST筛查候选II类萜烯合酶基因，结合RT-PCR和5' RACE克隆全长cDNA；在大肠杆菌中重组表达并纯化，以GGPP为底物进行酶学分析，通过GC-MS鉴定产物；采用UV照射和茉莉酸甲酯处理结合定量RT-PCR分析mRNA表达模式；通过序列比对分析II类萜烯合酶的保守区域。
核心内容
该研究从水稻中功能鉴定了syn-柯巴基二磷酸合酶（OsCPSsyn），并阐明其在二萜类植保素/化感物质生物合成中的关键作用。研究者利用水稻基因组和cDNA数据库筛查候选II类萜烯合酶基因，通过RT-PCR和5‘ RACE克隆全长cDNA，在大肠杆菌中重组表达并纯化蛋白，以GGPP为底物进行体外酶学分析，结合GC-MS鉴定产物，并通过UV照射和茉莉酸甲酯处理结合定量RT-PCR分析表达模式。关键结果显示，OsCPSsyn全长开放阅读框为2304 bp，重组表达的假成熟形式可将GGPP转化为syn-CPP，而全长前体无活性，其N端存在46个氨基酸的转运肽。表达分析表明，UV照射和0.5 mM甲基茉莉酸处理可诱导叶片中OsCPSsyn mRNA积累，未处理叶片几乎不表达，根中呈组成型表达，且mRNA诱导早于植保素积累。序列比较显示OsCPSsyn与ent-CPP合酶有38%-44%氨基酸同一性，其“insertional”区域和中央区域高度保守，而C端结构域同一性低于20%，提示该保守元件在II类环化反应中具有重要功能。该研究首次直接证明OsCPSsyn的催化功能，并揭示其转录调控是syn-labdane相关二萜类防御性天然产物生物合成的关键调控点，为深入理解水稻化学防御机制和代谢工程改造提供了重要基础。
创新点
['首次从水稻中功能鉴定了syn-柯巴基二磷酸合酶（OsCPSsyn），填补了该酶一直未被直接证明的空白', '发现了与已知ent-或normal-CPP合酶不同的新立体化学结果，即通过椅-船式构象环化生成syn-CPP', '证实OsCPSsyn的转录调控是syn-labdane相关二萜类植保素/化感物质生物合成的关键调控点', "揭示II类萜烯合酶中'insertional'序列元件高度保守，暗示其在催化中的功能作用"]
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 水稻（Oryza sativa L. ssp. indica cv. IR24） | 水稻二萜类植保素/化感物质生物合成（syn-labdane相关二萜类） | OsCPSsyn（syn-copalyl diphosphate synthase） | OsCPSsyn（II类萜烯合酶） | 催化 | 催化GGPP环化生成syn-CPP，是syn-labdane类二萜生物合成的关键步骤 |
| 大肠杆菌（E. coli C41） | 重组表达与酶学分析 | OsCPSsyn | OsCPSsyn（重组蛋白） | 催化 | 假成熟形式（缺失转运肽）具有活性，全长前体蛋白无活性；产物经GC-MS确认为syn-CPP |
| 水稻（Oryza sativa） | 二萜类植保素/化感物质生物合成（syn-labdane相关） | OsCPSsyn | OsCPSsyn | 调控 | mRNA表达受UV照射和甲基茉莉酸诱导，在根中组成性表达；其转录是代谢调控的关键节点 |
关键发现
- OsCPSsyn全长开放阅读框为2304 bp，其编码的蛋白N端存在46个氨基酸的转运肽（pl
- 9，整体pl
- 5）。重组表达假成熟形式（pseudomature construct）在体外可将GGPP转化为syn-CPP，而全长前体蛋白无活性。OsCPSsyn与被子植物ent-CPP合酶有38%-44%的氨基酸同一性，与裸子植物双功能酶约28%同一性；其'insertional'区域和中央区域同一性≥40%，而C端结构域同一性<20%（部分情况下更低），与含'insertional'元件的I类酶（同一性低至25%）形成对比。表达分析显示，UV照射和0.5 mM甲基茉莉酸处理可诱导水稻叶片中OsCPSsyn mRNA积累，而未处理叶片中几乎不表达；在4周龄水稻根中呈组成型表达。OsCPSsyn mRNA的诱导早于植保素积累。
研究结论
运用功能基因组学方法从水稻中鉴定了syn-CPP合酶（OsCPSsyn），证明其催化GGPP环化生成syn-CPP，是syn-labdane相关二萜类植保素/化感物质生物合成的关键步骤。OsCPSsyn的转录在叶片中受UV和茉莉酸甲酯诱导，在根中组成性表达，表明转录调控是控制这些防御性天然产物产生的重要调控点。序列比较显示II类萜烯合酶中'insertional'序列元件高度保守，提示该区域在II类环化反应中具有重要功能。