The hexanyol-CoA precursor for cannabinoid biosynthesis is formed by an acyl-activating enzyme in Cannabis sativa trichomes
- 作者
- Jake M. Stout, Zakia Boubakir, Stephen J. Ambrose, Randy W. Purves, Jonathan E. Page
- 单位
- Plant Biotechnology Institute, National Research Council of Canada; Department of Biology, University of Saskatchewan
- 杂志
- The Plant Journal（2012）
- DOI
- 10.1111/j.1365-313X.2012.04949.x
- 所属领域
- 代谢工程 / 植物代谢
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
大麻素生物合成中己酰-CoA前体的形成机制尚不明确，需要鉴定催化己酸生成己酰-CoA的酰基活化酶（AAE）并阐明其在大麻腺毛中的功能。
研究策略
利用LC-MS/MS定量大麻组织中的己酰-CoA和CBDA，结合腺毛转录组EST分析鉴定候选AAE基因；通过异源表达、体外酶活测定、动力学分析、亚细胞定位及系统进化分析，确定CsAAE1和CsAAE3的功能。
核心内容
该研究在大麻腺毛中鉴定出催化己酸生成己酰-CoA的关键酰基活化酶CsAAE1，并阐明其在大麻素生物合成前体形成中的功能。通过LC-MS/MS定量发现雌花中己酰-CoA含量为15.5±5.7 pmol/g FW，远高于叶片、茎和根；结合腺毛转录组EST分析获得11个AAE基因，其中CsAAE1转录丰度最高（42 ESTs）。异源表达与酶活测定表明，重组CsAAE1特异偏好己酸（Km=3.7 mM，kcat=2.0 s⁻¹），定位于细胞质；而CsAAE3为广底物过氧化物酶体酰基-CoA合成酶（己酸Km=261 μM，癸酸Km=16.1 μM，棕榈酸Km=1.3 μM）。系统进化分析显示CsAAE1是clade IIa中唯一缺乏过氧化物酶体靶向信号PTS1的成员，其旁系同源CsAAE12保留了功能性PTS1，提示CsAAE1通过丢失PTS1从过氧化物酶体酶新功能化为细胞质大麻素途径酶。该发现为大麻素途径的异源重构和低大麻素品种育种提供了关键基因靶点。
创新点
首次在Cannabis sativa中鉴定出定位于细胞质的己酰-CoA合成酶CsAAE1，并提出其通过丢失过氧化物酶体靶向信号PTS1从过氧化物酶体酶新功能化为细胞质大麻素途径酶；同时发现CsAAE3为广底物过氧化物酶体酰基-CoA合成酶。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cannabis sativa | 大麻素生物合成 | CsAAE1 | CsAAE1 | 催化 | 细胞质己酰-CoA合成酶，催化己酸生成己酰-CoA，为聚酮合酶提供底物，高表达于腺毛 |
| Cannabis sativa | 脂肪酸β-氧化 | CsAAE3 | CsAAE3 | 催化 | 过氧化物酶体酰基-CoA合成酶，广底物谱，包括己酸、癸酸和棕榈酸，含非经典PTS1 |
| Cannabis sativa | 大麻素生物合成 | OLS | Olivetol synthase | 催化 | III型聚酮合酶，催化己酰-CoA与丙二酰-CoA缩合生成橄榄醇酸，定位于细胞质 |
| Cannabis sativa | 大麻素生物合成 | THCAS | Tetrahydrocannabinolic acid synthase | 催化 | 氧化环化酶，催化CBGA生成THCA |
| Cannabis sativa | 大麻素生物合成 | CBDAS | Cannabidiolic acid synthase | 催化 | 氧化环化酶，催化CBGA生成CBDA，在'Finola'品种中高表达 |
| Escherichia coli | 异源重组蛋白表达 | CsAAE1 | CsAAE1 | 催化 | 在Rosetta 2 (DE3)中表达纯化，用于体外酶活测定 |
| Escherichia coli | 异源重组蛋白表达 | CsAAE3 | CsAAE3 | 催化 | 在Rosetta 2 (DE3)中表达纯化，用于体外酶活测定 |
| Nicotiana benthamiana | 亚细胞定位 | CsAAE1 | YFP:CsAAE1 | 调控 | 瞬时表达显示定位于细胞质，与OLS:CFP共定位 |
| Nicotiana benthamiana | 亚细胞定位 | CsAAE3 | YFP:CsAAE3 | 调控 | 瞬时表达显示定位于过氧化物酶体，与PX-CK标记共定位 |
关键发现
- 雌花中己酰-CoA含量为15.5±5.7 pmol/g FW，CBDA含量为2.4±0.8 μmol/g FW，叶片、茎和根中显著较低
- 大麻腺毛转录组鉴定出11个AAE基因，CsAAE1转录丰度最高（42 ESTs，占0.46%）
- 重组CsAAE1和CsAAE3均能催化己酰-CoA合成，最适温度40°C、pH 9
- CsAAE1偏好己酸（Km=3.7±0.7 mM，kcat=2.0 s-1），而CsAAE3底物谱宽（己酸Km=261±37 μM，kcat=57.6 s-1
- 癸酸Km=16.1±5.8 μM
- 棕榈酸Km=1.3±0.5 μM）
- CsAAE1定位于细胞质，CsAAE3定位于过氧化物酶体
- 系统进化分析显示CsAAE1属于clade IIa，是唯一缺乏PTS1的成员，且其相邻的旁系同源CsAAE12具有功能PTS1，支持CsAAE1通过亚细胞定位改变实现新功能化。
研究结论
CsAAE1是参与大麻素生物合成的细胞质己酰-CoA合成酶，通过丢失PTS1从过氧化物酶体酰基活化酶演化而来；CsAAE3是参与脂肪酸β-氧化的过氧化物酶体广底物酰基-CoA合成酶。己酸可能由不饱和脂肪酸经脂氧合酶途径产生。该研究为大麻素途径的异源重构和低大麻素品种育种提供了关键基因靶点。