Cloning and characterization of Enterobacter sakazakii pigment genes and in situ spectroscopic analysis of the pigment
- 作者
- Angelika Lehner, Maya Grimm, Thomas Rattei, Andreas Ruepp, Dmitrij Frishman, Giuseppe G.G. Manzardo, Roger Stephan
- 单位
- Institute for Food Safety and Hygiene, Vetsuisse Faculty, University of Zurich, Zurich, Switzerland; Genome oriented Bioinformatics, Technische Universitaet Munchen, Freising, Germany; Institute for Bioinformatics (MIPS), GSF National Research Center for Environment and Health, Neuherberg, Germany; Technische Universitaet Munchen, Wissenschaftszentrum Weihenstephan, Freising, Germany; Laboratory of Food Chemistry, Institute of Food Science, ETH Zurich, Zurich, Switzerland
- DOI
- 10.1111/j.1574-6968.2006.00500.x
- 所属领域
- 微生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）产生黄色色素的分子机制未知，需要克隆并表征其色素生物合成基因，并通过原位光谱分析确定色素性质。
研究策略
采用BAC文库构建和异源表达策略，将阪崎肠杆菌ES5菌株的DNA片段克隆至大肠杆菌中，筛选黄色转化子；对插入片段进行测序和生物信息学注释，鉴定类胡萝卜素合成基因簇；利用原位可见微光谱和共振拉曼微光谱分析色素。
核心内容
阪崎肠杆菌产生黄色色素的分子机制此前并不清楚，该研究通过构建BAC文库并将阪崎肠杆菌ES5菌株的DNA片段异源表达于大肠杆菌中，筛选到黄色转化子并克隆了负责色素合成的基因簇。对插入片段测序和注释后发现，BAC片段全长为33,025 bp，包含28个编码序列，平均GC含量60.5%，黄色克隆比例约为7:1100。基因簇组织为crtE-idi-XYIBZ，其中crtE-idi-XYIB可能构成一个操纵子，而crtZ反向转录。原位可见微光谱显示阪崎肠杆菌ES5及其转化子9E10在432、458和485 nm处具有特征吸收峰，拉曼光谱在1521、1157和1005 cm⁻¹处呈现典型类胡萝卜素信号，与含9个共轭双键的C40类胡萝卜素相符，说明该色素可能为β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质及其糖苷。这证实了阪崎肠杆菌的黄色色素由crtE-idi-XYIBZ基因簇编码，异源表达验证了其功能，为后续研究该菌色素调控、环境持久性及毒力机制提供了分子基础。
创新点
首次克隆并表征了阪崎肠杆菌的类胡萝卜素生物合成基因簇，组织为crtE-idi-XYIBZ；通过异源表达和原位光谱确认色素为类胡萝卜素，为后续调控机制和毒力研究奠定基础。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Enterobacter sakazakii ES5 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE (geranylgeranyl pyrophosphate synthase, 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶) | 催化 | 催化FPP延伸为C40类胡萝卜素前体 |
| Enterobacter sakazakii ES5 | 类胡萝卜素生物合成 | idi | Idi (isopentyl pyrophosphate isomerase, 异戊烯焦磷酸异构酶) | 催化 | 位于crtE和crtX之间，可能提高类胡萝卜素产量 |
| Enterobacter sakazakii ES5 | 类胡萝卜素生物合成 | crtX | CrtX (zeaxanthin glucosylase, 玉米黄质葡萄糖苷酶) | 催化 | 催化β-胡萝卜素的进一步修饰生成C40类胡萝卜素 |
| Enterobacter sakazakii ES5 | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | CrtY (lycopene cyclase, 番茄红素环化酶) | 催化 | 将番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Enterobacter sakazakii ES5 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI (phytoene dehydrogenase, 八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢 |
| Enterobacter sakazakii ES5 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB (phytoene synthase, 八氢番茄红素合酶) | 催化 | 催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸生成八氢番茄红素 |
| Enterobacter sakazakii ES5 | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | CrtZ (β-carotene hydroxylase, β-胡萝卜素羟化酶) | 催化 | 催化β-胡萝卜素羟基化生成玉米黄质等 |
关键发现
- 克隆的BAC插入片段大小为33.025 bp，预测37个ORFs，最终保留28个CDS，平均长度954.4 bp，平均GC含量60.5%
- 黄色克隆比例为7:1100
- 基因簇组织为crtE-idi-XYIBZ，其中crtE-idi-XYIB可能为操纵子，crtZ反向转录
- 氨基酸同一性与已知菌株比较最高达82% (CrtI vs Pantoea ananas)
- 原位可见光谱显示阪崎肠杆菌ES5和大肠杆菌转化子9E10在432、458、485 nm处有吸收峰，而对照大肠杆菌EPI100无此峰
- 拉曼光谱在1521 cm⁻¹ (ν1)、1157 cm⁻¹ (ν2)和1005 cm⁻¹处有特征峰，符合含9个共轭双键的类胡萝卜素
- 色素可能为β-胡萝卜素、β-隐黄质、玉米黄质及其糖苷。
研究结论
阪崎肠杆菌的黄色色素是由类胡萝卜素生物合成基因簇crtE-idi-XYIBZ编码的C40类胡萝卜素，异源表达验证了其功能；原位光谱分析证实色素具有典型类胡萝卜素特征。该研究为深入理解阪崎肠杆菌色素的调控、环境持久性及毒力作用提供了分子基础。