The metabolite chemotype of Nicotiana benthamiana transiently expressing artemisinin biosynthetic pathway genes is a function of CYP71AV1 type and relative gene dosage
- 作者
- Heng-Ming Ting, Bo Wang, Anna-Margareta Rydén, Lotte Woittiez, Teun van Herpen, Francel W. A. Verstappen, Carolien Ruyter-Spira, Jules Beekwilder, Harro J. Bouwmeester, Alexander van der Krol
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University; Plant Research International
- 杂志
- New Phytologist（2013）
- DOI
- 10.1111/nph.12274
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
探明青蒿（Artemisia annua）高青蒿素生产（HAP）与低青蒿素生产（LAP）化学型差异的分子基础，特别是青蒿素生物合成途径下游基因（CYP71AV1、DBR2、ALDH1）的酶活性差异如何决定化学型。
研究策略
从HAP和LAP两种化学型青蒿中克隆CYP71AV1、DBR2和ALDH1基因，比较蛋白序列与酶活性；利用农杆菌介导的本氏烟草瞬时表达系统，将青蒿素生物合成途径基因（ADS+FPS+HMGR）与不同变体组合共表达，通过LC-QTOF-MS、UPLC-MRM-MS和GC-MS分析产物谱，并考察基因相对剂量对产物比例的影响。
核心内容
该研究通过比较青蒿高青蒿素生产（HAP）与低青蒿素生产（LAP）两种化学型中青蒿素合成途径关键酶的差异，揭示了化学型形成的分子基础。研究者从两种化学型中克隆了CYP71AV1、DBR2和ALDH1基因，并借助农杆菌介导的本氏烟草瞬时表达系统，将青蒿素合成途径基因与不同变体组合共表达，利用质谱分析产物谱。结果显示，HAP来源的AMOLAP比LAP来源的AMOHAP多出7个N端氨基酸，这一结构差异导致酶活性显著不同：共表达AMOLAP时游离青蒿酸产量约39.9 mg kg⁻¹ FW，而AMOHAP处理中青蒿酸低于检测限，仅产生24.0 mg kg⁻¹ FW的青蒿醇；总产物产量约为后者的2倍。加入DBR2和ALDH1后，AMOLAP组合的青蒿酸和二氢青蒿酸分别达8836和10792 mg kg⁻¹ FW，远高于AMOHAP组合的2589和2756 mg kg⁻¹ FW。基因剂量稀释实验进一步表明，降低AMOLAP剂量可模拟AMOHAP表型，降低DBR2剂量使化学型由HAP转向LAP。研究还发现内源糖基化、丙二酰化和谷胱甘肽结合等修饰反应限制了二氢青蒿酸积累。该工作证明青蒿化学型差异主要源于CYP71AV1的N端结构变异及基因相对剂量，为理解植物天然产物代谢异质性提供了新视角。
创新点
首次系统比较HAP与LAP化学型来源的CYP71AV1、DBR2和ALDH1；发现CYP71AV1的N端7氨基酸延伸（AMOLAP特有）导致酶活性与产物谱差异；证明本氏烟草中‘化学型’由CYP71AV1类型及DBR2/ALDH1相对剂量共同决定；检测到CYP71AV1产物AAA的谷胱甘肽结合物。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成途径 | — | — | 催化 | 农杆菌浸润瞬时表达平台，用于重构青蒿素前体合成通路 |
| Arabidopsis thaliana | — | — | — | 区室化 | 原生质体瞬时表达用于CYP71AV1的亚细胞定位研究 |
| — | 青蒿素生物合成途径 | CYP71AV1 | AMOLAP/AMOHAP | 催化 | 紫穗槐二烯氧化酶，催化AD氧化为AAOH、AAA和AA；AMOLAP含N端7氨基酸延伸，活性高于AMOHAP |
| — | 青蒿素生物合成途径 | DBR2 | DBR2HAP/DBR2LAP | 催化 | 青蒿醛双键还原酶，催化AAA还原为DHAAA；HAP与LAP来源变体活性无差异 |
| — | 青蒿素生物合成途径 | ALDH1 | ALDH1 | 催化 | 醛脱氢酶，催化DHAAA氧化为DHAA及AAA氧化为AA；HAP与LAP来源蛋白序列一致 |
| — | 青蒿素生物合成途径 | ADS | 紫穗槐二烯合酶 | 催化 | 催化FPP环化生成紫穗槐二烯，本研究中与线粒体靶向信号融合表达 |
| — | 甲羟戊酸途径/青蒿素前体供给 | FPS | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP，线粒体靶向表达以增强前体供给 |
| — | 甲羟戊酸途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 截短胞质形式，促进甲羟戊酸途径通量 |
关键发现
- AMOLAP比AMOHAP多7个N端氨基酸，二者均定位于内质网，但AMOHAP可能稳定性较低。在本氏烟草中瞬时表达AmFH（ADS+FPS+HMGR）与AMOLAP时，游离AA产量约39.9 mg kg-1 FW，而AMOHAP处理中AA低于检测限，AAOH产量为24.0 mg kg-1 FW
- AmFH+AMOLAP总产物产量约为AmFH+AMOHAP的2倍。共表达DBR2后，AmFH+AMOLAP+DBR2处理的DHAA为7.3 mg kg-1 FW，AmFH+AMOHAP+DBR2的DHAA低于检测限
- 添加ALDH1后，AmFH+AMOLAP+DBR2+ALDH1处理中AA和DHAA分别达8836±1730和10792±341 mg kg-1 FW，AmFH+AMOHAP+DBR2+ALDH1处理中AA为2589±563、DHAA为2756±547 mg kg-1 FW，DHAA产量分别提高约13倍（AMOLAP组合）和约110倍（AMOHAP组合）。DBR2与ALDH1基因剂量稀释实验表明，降低AMOLAP剂量模拟AMOHAP表型，降低DBR2剂量使化学型由HAP转向LAP，降低ALDH1剂量主要减少AA缀合物。
研究结论
青蒿HAP与LAP化学型的差异主要源于CYP71AV1的N端结构差异（AMOLAP的7氨基酸延伸）导致的酶活性差异，DBR2和ALDH1在两种化学型间无功能差异；本氏烟草瞬时表达体系的产物‘化学型’是CYP71AV1类型与相对基因剂量的函数。内源糖基化、丙二酰化和谷胱甘肽结合等修饰反应限制了DHAA的积累，从而影响青蒿素前体产率。