An R2R3-MYB transcription factor represses the transformation of α- and β-branch carotenoids by negatively regulating expression of CrBCH2 and CrNCED5 in flaved of Citrus reticulate
- 作者
- Feng Zhu, Tao Luo, Chaoyang Liu, Yang Wang, Hongbin Yang, Wei Yang, Li Zheng, Xue Xiao, Mingfei Zhang, Rangwei Xu, Jianguo Xu, Yunliu Zeng, Juan Xu, Qiang Xu, Wenwu Guo, Robert M. Larkin, Xiuxin Deng, Yunjiang Cheng
- 单位
- Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Huazhong Agricultural University; Key Laboratory of Horticultural Crop Biology and Genetic improvement (Central Region), Ministry of Agriculture, Huazhong Agricultural University; The Institute of Citrus Science, Huazhong Agricultural University; Zhejiang Citrus Research Institute
- 杂志
- New Phytologist（2017）
- DOI
- 10.1111/nph.14684
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
类胡萝卜素代谢中α-和β-分支转化的转录调控机制尚不清楚，尤其是直接调控这些分支关键酶基因表达的转录因子未知。
研究策略
利用柑橘stay-green突变体（Green Ougan, MT）及其回复突变体（MT-WT），结合转录组分析、SAAB/EMSA体外结合实验、双荧光素酶报告系统、烟草叶片瞬时过表达等手段，鉴定并验证调控类胡萝卜素α/β分支转化的转录因子及其靶基因。
核心内容
该研究以柑橘stay-green突变体及其回复突变体为材料，鉴定了调控类胡萝卜素α/β分支转化的转录因子CrMYB68。通过转录组分析、SAAB/EMSA体外结合实验、双荧光素酶报告系统及烟草叶片瞬时过表达，证实CrMYB68可直接结合CrBCH2启动子的ACCAAC基序和CrNCED5启动子的ACCAAA基序并抑制其转录。在210 DAF时，突变体果皮中α-胡萝卜素（7.96 μg/g FW）和β-胡萝卜素（18.87 μg/g FW）显著高于野生型（分别为1.20和4.41 μg/g FW），而玉米黄质（1.69 μg/g FW）显著低于野生型（21.41 μg/g FW）；CrBCH2和CrNCED5表达水平分别降低6倍和23倍，ABA含量亦下降。回复突变体中CrMYB68表达降低，上述表型恢复至野生型水平。结果表明CrMYB68作为转录抑制因子，通过负调控CrBCH2和CrNCED5表达抑制α/β-胡萝卜素向叶黄素类转化及ABA合成，是柑橘果实着色和类胡萝卜素积累的关键上游调节因子。
创新点
首次发现R2R3-MYB转录因子CrMYB68可直接结合并负调控CrBCH2和CrNCED5的启动子，从而抑制α-和β-分支类胡萝卜素的转化及ABA的生物合成；利用自然回复突变体为转基因验证提供了等效的体内证据。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Citrus reticulata (cv. Suavissima) 果实flavedo | 类胡萝卜素代谢（α/β分支）与ABA生物合成 | CrBCH2 | β-胡萝卜素羟化酶2 | 催化 | 催化α-和β-胡萝卜素的羟基化，其表达受CrMYB68负调控 |
| Citrus reticulata (cv. Suavissima) 果实flavedo | ABA生物合成 | CrNCED5 | 9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶5 | 催化 | 催化类胡萝卜素裂解为ABA前体，其表达受CrMYB68负调控 |
| Citrus reticulata (cv. Suavissima) 果实flavedo | 类胡萝卜素代谢调控 | CrMYB68 | R2R3-MYB转录因子CrMYB68 | 调控 | 核定位转录抑制因子，直接结合CrBCH2和CrNCED5启动子并抑制其表达 |
| Nicotiana benthamiana 叶片（瞬时过表达体系） | 类胡萝卜素代谢与ABA生物合成 | NbBCH2, NbNCED5 | 本氏烟BCH2和NCED5 | 催化 | CrMYB68在烟草中瞬时过表达可抑制NbBCH2和NbNCED5表达 |
| 水稻原生质体（双荧光素酶实验） | 转录调控 | CrBCH2, CrNCED5（启动子）-LUC报告系统 | CrMYB68 | 调控 | CrMYB68显著抑制CrBCH2和CrNCED5启动子驱动的荧光素酶活性 |
关键发现
- 在210 DAF时，MT果皮中α-胡萝卜素（7.96±1.94 μg/g FW）和β-胡萝卜素（18.87±5.17 μg/g FW）显著高于WT（分别为1.20±0.40和4.41±1.28 μg/g FW），而玉米黄质（1.69±0.49 μg/g FW）显著低于WT（21.41±6.06 μg/g FW）
- ABA含量MT（1.50±0.24 μg/g FW）低于WT（2.34±0.45 μg/g FW）。CrBCH2和CrNCED5在MT中表达量分别比WT降低6倍和23倍。CrMYB68表达与这些基因呈负相关。EMSA和双荧光素酶实验证明CrMYB68直接结合CrBCH2启动子中的ACCAAC基序和CrNCED5启动子中的ACCAAA基序并抑制其转录。烟草瞬时过表达CrMYB68可抑制NbBCH2和NbNCED5表达。回复突变体MT-WT中CrMYB68表达降低，CrBCH2和CrNCED5表达升高，类胡萝卜素和ABA表型恢复至接近WT水平。
研究结论
CrMYB68作为转录抑制因子，直接负调控CrBCH2和CrNCED5的表达，从而抑制α-和β-胡萝卜素向叶黄素类转化并减少ABA合成，是调控柑橘类胡萝卜素代谢和果实着色的重要上游调节因子。