Towards take-all control: a C-21β oxidase required for acylation of triterpene defence compounds in oat
- 作者
- Aymeric Leveau, James Reed, Xue Qiao, Michael J. Stephenson, Sam T. Mugford, Rachel E. Melton, Jenni C. Rant, Robert Vickerstaff, Tim Langdon, Anne Osbourn
- 单位
- Department of Metabolic Biology, John Innes Centre; Department of Genetics and Crop Improvement, East Malling Research; Institute of Biological, Environmental and Rural Sciences, Aberystwyth University
- 杂志
- New Phytologist（2019）
- DOI
- 10.1111/nph.15456
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定燕麦avenacin生物合成途径中负责三萜骨架C-21β位氧化的关键酶，以完成该途径并应用于全蚀病防控。
研究策略
利用燕麦根尖转录组数据挖掘候选细胞色素P450基因，结合遗传连锁分析，在本氏烟草中瞬时共表达筛选催化活性，并通过燕麦sad6突变体验证功能。
核心内容
本研究鉴定并功能验证了燕麦avenacin三萜防御化合物生物合成途径中的关键C-21β氧化酶AsCYP72A475（与遗传位点Sad6同源）。通过分析燕麦根尖转录组筛选候选细胞色素P450基因，结合遗传连锁分析及本氏烟草瞬时共表达筛选，作者确认该酶催化β-amyrin衍生物的C-21β位羟基化，其产物为12,13β-环氧,16β,21β-二羟基-β-amyrin-3β-O-L-阿拉伯糖，共纯化获得81.4 mg并经NMR确证。在燕麦sad6突变体中，该酶功能缺失导致产物无法进行后续酰化修饰，积累des-acyl,des-21-hydroxy-avenacin A，并显著增强对全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici的感病性。值得注意的是，大豆GmCYP72A69与AsCYP72A475氨基酸一致性仅46%，且两者底物偏好不同。该酶的发现填补了avenacin生物合成途径中连接三萜骨架与莽草酸途径酰基供体的关键空白，为通过代谢工程在小麦等作物中重建该抗病途径提供了核心功能元件。
创新点
首次从单子叶植物中鉴定出三萜C-21β氧化酶AsCYP72A475，证明其与遗传位点Sad6同源，填补了avenacin生物合成途径中连接萜类骨架与莽草酸途径酰基供体的关键空白；为将avenacin途径工程化导入小麦等作物奠定基础。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Avena strigosa | avenacin生物合成（三萜皂苷） | AsCYP72A475 (Sad6) | AsCYP72A475 | 催化 | C-21β羟化酶，CYP72A亚家族，催化β-amyrin衍生物C-21β羟基化 |
| Avena strigosa | avenacin生物合成 | AsbAS1 (Sad1) | β-amyrin合酶 | 催化 | 催化2,3-氧化角鲨烯环化生成β-amyrin |
| Avena strigosa | avenacin生物合成 | AsCYP51H10 (Sad2) | AsCYP51H10 | 催化 | 多功能细胞色素P450，催化12,13β-环氧和16β-羟基化 |
| Avena strigosa | avenacin生物合成 | AsAAT1 | 阿拉伯糖基转移酶 | 催化 | 催化C-3位阿拉伯糖基化 |
| Avena strigosa | avenacin生物合成 | AsSCPL1 (Sad7) | 丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶 | 催化 | 催化C-21β位N-甲基邻氨基苯甲酰基转移 |
| Avena strigosa | avenacin生物合成 | AsMT1 (Sad9) | 邻氨基苯甲酸N-甲基转移酶 | 催化 | 参与合成N-甲基邻氨基苯甲酸酰基供体 |
| Avena strigosa | avenacin生物合成 | AsUGT74H5 (Sad10) | UDP-糖基转移酶 | 催化 | 生成N-甲基邻氨基苯甲酰基葡萄糖苷 |
| Glycine max | 大豆皂苷生物合成 | GmCYP72A69 | GmCYP72A69 | 催化 | 大豆C-21β氧化酶，与燕麦AsCYP72A475仅46%氨基酸一致性，可直接氧化β-amyrin |
| Nicotiana benthamiana | 瞬时表达系统（异源重组avenacin途径） | AstHMGR | HMG-CoA还原酶（反馈不敏感型） | 催化 | 增强甲羟戊酸途径通量，提高三萜前体供给 |
关键发现
- AsCYP72A475催化β-amyrin衍生物C-21β羟基化，产物为12,13β-环氧,16β,21β-二羟基-β-amyrin-3β-O-L-阿拉伯糖（EpidHβA-3-Ara），共纯化获得81.4 mg该化合物并经NMR确证
- sad6突变体（#825、#1243等14个）缺乏C-21β羟基化导致无法酰化，积累des-acyl,des-21-hydroxy-avenacin A，并显著增强对全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici的感病性
- AsCYP72A475与大豆GmCYP72A69氨基酸一致性仅46%，但后者可氧化β-amyrin而燕麦酶不能，两者底物偏好不同
- 在55个额外未表征突变体中发现12个携带AsCYP72A475突变。
研究结论
AsCYP72A475（Sad6）是燕麦avenacin生物合成所必需的C-21β羟化酶，其催化产物是后续酰化修饰和抗真菌活性的前提。该酶的鉴定完善了对三萜生物合成的认识，并为通过代谢工程在小麦等作物中重建avenacin抗病途径提供了关键元件。