Valencene synthase from the heartwood of Nootka cypress (Callitropsis nootkatensis) for biotechnological production of valencene
- 作者
- Jules Beekwilder, Adèle van Houwelingen, Katarina Cankar, Aalt D.J. van Dijk, René M. de Jong, Geert Stoopen, Harro Bouwmeester, Jihane Achkar, Theo Sonke, Dirk Bosch
- 单位
- Plant Research International, Wageningen, the Netherlands; Platform Green Synthetic Biology, Delft University of Technology, Delft, the Netherlands; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Wageningen, the Netherlands; DSM Biotechnology Center, Delft, the Netherlands; Isobionics, Geleen, the Netherlands; Department of Chemistry, Utrecht University, Utrecht, the Netherlands
- 杂志
- Plant Biotechnology Journal（2014）
- DOI
- 10.1111/pbi.12124
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
柑橘来源的瓦伦烯合酶在微生物宿主中催化效率低，难以实现瓦伦烯的工业化生物生产，需要寻找更稳健高效的瓦伦烯合酶。
研究策略
从黄柏（Nootka cypress）心材中通过大规模EST测序和功能筛选鉴定新型瓦伦烯合酶基因CnVS，进行体外酶学表征，并在酿酒酵母和类球红细菌中异源表达验证其生产潜力。
核心内容
该研究从黄柏（Nootka cypress）心材中通过大规模EST测序和功能筛选鉴定出新型瓦伦烯合酶基因CnVS，并对其进行了体外酶学表征及微生物异源表达验证。酶动力学数据显示CnVS与柑橘来源的CitrusVS催化效率相近，但CnVS在pH 5–10范围内活性稳定，而CitrusVS仅在pH 7附近有活性；40°C时CnVS活性最高，且在4°C低温与52°C高温下仍保留显著活性，CitrusVS则几乎完全失活。在未优化的酿酒酵母WAT11中，表达CnVS的瓦伦烯产量为1.36 mg/L，而CitrusVS仅为0.0021 mg/L；在类球红细菌中表达CnVS产量达57.5 mg/L，较CitrusVS提高20倍以上，共表达甲羟戊酸途径后进一步升至352 mg/L，比CitrusVS高14倍。结果表明，CnVS作为一种更稳健的裸子植物来源合酶，在微生物宿主中蛋白积累量更高，显著优于柑橘来源酶，具备工业化生产瓦伦烯的潜力，并可作为诺卡酮生物合成途径的首个关键酶。
创新点
首次从裸子植物黄柏中克隆到瓦伦烯合酶CnVS，属于gymnosperm特异性TPS-d亚家族，与柑橘来源的瓦伦烯合酶同源性低；该酶在宽pH和温度范围内具有高稳健性，在微生物宿主中蛋白积累量更高，显著提升瓦伦烯产量。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 萜类合成 | CnVS | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 用于重组蛋白表达和体外酶活验证 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | CnVS | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 在WAT11菌株中表达，产量1.36 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | CitrusVS | 瓦伦烯合酶（来自葡萄柚） | 催化 | 对照，产量仅0.0021 mg/L |
| Rhodobacter sphaeroides | 萜类合成 | CnVS | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 密码子优化并融合MBP标签，产量57.5 mg/L；共表达甲羟戊酸途径后达352 mg/L |
| Rhodobacter sphaeroides | 萜类合成 | CitrusVS | 瓦伦烯合酶（来自葡萄柚） | 催化 | 对照，产量2.5 mg/L，共表达甲羟戊酸途径后24.9 mg/L |
| Callitropsis nootkatensis | 诺卡酮生物合成 | CnVS | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 在心材中表达与诺卡酮含量相关，是诺卡酮生物合成的第一个专一性酶 |
| Rhodobacter sphaeroides | 甲羟戊酸途径 | MEV operon | 甲羟戊酸途径酶 | 能量供给 | 来自Paracoccus zeaxanthinifaciens的甲羟戊酸操纵子，用于增加FPP底物供应 |
| Escherichia coli | 萜类合成 | CnVS | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 体外产物包括瓦伦烯和少量germacrene A |
关键发现
- CnVS与柑橘瓦伦烯合酶CitrusVS的Km值分别为1.04±0.36 μM和0.52±0.10 μM，kcat/Km分别为3.4×10^-3和5.0×10^-3 m/s，差异不大
- 但CnVS在pH 5-10范围内活性稳定，而CitrusVS仅在pH 7附近有活性
- 在40°C时CnVS活性最高，且低温4°C和高温52°C仍有显著活性，而CitrusVS几乎无活性
- 在未优化的酿酒酵母WAT11中，表达CnVS的瓦伦烯产量为1.36±0.05 mg/L，而CitrusVS仅0.0021 mg/L
- 在类球红细菌中，表达CnVS的产量为57.5±3.5 mg/L，比CitrusVS（2.5 mg/L）高20倍以上
- 共表达甲羟戊酸途径后，CnVS产量达到352±37 mg/L，比CitrusVS（24.9 mg/L）提高14倍
- Nootka cypress心材提取物中瓦伦烯合酶活性为0.4 nmol/min/g。
研究结论
CnVS是一种比柑橘来源合酶更稳健、在微生物宿主中表现更优的瓦伦烯合酶，在类球红细菌工程菌株中可实现352 mg/L的瓦伦烯产量，具有工业化应用潜力，并可作为诺卡酮生物合成途径的首个关键酶。