Product stability and sequestration mechanisms in Solanum tuberosum engineered to biosynthesize high value ketocarotenoids
- 作者
- Cara L. Mortimer, Norihiko Misawa, Laurence Ducreux, Raymond Campbell, Peter M. Bramley, Mark Taylor, Paul D. Fraser
- 单位
- Centre for Systems and Synthetic Biology, School of Biological Sciences Royal Holloway University of London, Egham, Surrey, UK; Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University, Nonoichi-machi, Ishikawa, Japan; Cell and Molecular Sciences, The James Hutton Institute, Invergoury, Dundee, UK; Present address: Centre for Tropical Crops and Biocommodities, Queensland University of Technology, Brisbane, Qld 4001, Australia
- 杂志
- Plant Biotechnology Journal（2016）
- DOI
- 10.1111/pbi.12365
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在马铃薯中异源生产高价值酮类胡萝卜素，并揭示产物稳定性及细胞内隔离/存储机制，同时评估对宿主代谢（尤其淀粉含量）的影响。
研究策略
通过农杆菌介导的遗传转化，将来自Brevundimonas的crtW和crtZ基因（密码子优化并靶向质体）置于CaMV35S组成型启动子下导入马铃薯品种Désirée，利用CRTW和CRTZ酶对内源类胡萝卜素进行修饰，结合HPLC-PDA、亚细胞分级、电子显微镜和生化分析表征产物种类、含量、稳定性及亚细胞定位。
核心内容
本研究在马铃薯品种Désirée中异源表达源自Brevundimonas的crtW和crtZ基因，通过农杆菌介导转化并靶向质体，系统考察了酮类胡萝卜素的合成、稳定性及亚细胞分布。结果显示，转基因叶片中酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素20%–34%，块茎中4-酮基叶黄素最高达13.70 μg/g DW，总类胡萝卜素32.30 μg/g DW。冷储6个月后，块茎总类胡萝卜素增至52.92 μg/g DW，但热加工（200°C烘烤或煮沸）显著降解，4-酮基叶黄素从9.71降至0.21 μg/g DW。亚细胞分析揭示酯化酮类胡萝卜素主要隔离于质体小球，非酯化形式与膜及淀粉粒结合，块茎中酯化比例从13%升至45%。此外，转基因块茎淀粉含量较野生型低16%，冷储后下降幅度更小，且PSII光化学效率仅微降8%。研究证明马铃薯可高效积累高价值酮类胡萝卜素，但产物稳定性受加工条件制约，且代谢工程对淀粉积累存在显著权衡，为植物源类胡萝卜素生物炼制及源库关系调控提供了重要参考。
创新点
首次在马铃薯中同时表达细菌crtW/crtZ并系统分析酮类胡萝卜素的积累与区室化分配；揭示了酯化酮类胡萝卜素被隔离在质体小球、非酯化形式与膜和淀粉粒结合；发现淀粉可与类胡萝卜素结合影响提取与稳定性；证明异源合成导致淀粉含量显著下降，对源库关系有重要影响。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Solanum tuberosum cv. Désirée | 类胡萝卜素生物合成 | crtW | CRTW（β-胡萝卜素酮化酶） | 催化 | 来自Brevundimonas sp.，催化β-紫罗酮环4,4'位引入酮基，可作用于β-胡萝卜素或含羟基底物。 |
| Solanum tuberosum cv. Désirée | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | CRTZ（β-胡萝卜素3,3'-羟化酶） | 催化 | 来自Brevundimonas sp.，催化β-紫罗酮环3,3'位引入羟基，可与CRTW协同生成虾青素等产物。 |
关键发现
- 转基因叶片中酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素的20%-34%（如E1P1(1)中4-酮基叶黄素3.06 μg/mg DW、虾青素0.31 μg/mg DW，总类胡萝卜素10.50 μg/mg DW，WT为15.33 μg/mg DW）
- 转基因块茎中4-酮基叶黄素达13.70 μg/g DW、总类胡萝卜素32.30 μg/g DW（WT为27.57 μg/g DW）
- 冷储存（4°C，6个月）后转基因块茎总类胡萝卜素从32.30增至52.92 μg/g DW，4-酮基叶黄素从13.70增至27.65 μg/g DW
- 热处理（200°C烘烤60min或煮沸30min）使转基因块茎总类胡萝卜素显著下降约两倍（44.41降至17.25 μg/g DW），其中4-酮基叶黄素从9.71降至0.21 μg/g DW
- 转基因块茎淀粉含量比WT低16%（鲜薯）和6%（冷储），冷储后WT下降20%、转基因下降10%
- 叶片质体小球中类胡萝卜素含量增加5倍（WT 0.13 μg/g FW，转基因0.49 μg/g FW），其中八氢番茄红素增加16倍
- 块茎中酯化类胡萝卜素比例从WT的13%升至转基因的45%，且由酮类胡萝卜素酯替代内源酯
- PSII光化学效率Fv/Fm下降8%，但叶绿素a/b比值无显著变化
- 体外实验表明淀粉可与虾青素结合。
研究结论
表达细菌crtW/crtZ可在马铃薯叶片和块茎中合成多种高价值酮类胡萝卜素，但导致淀粉含量显著降低。非内源类胡萝卜素的储存依赖于亚细胞区室化：酯化形式主要隔离于质体小球，非酯化形式与膜和淀粉粒结合。产物在冷储期间积累但在热加工中不稳定，不同化合物稳定性差异显著。研究为植物生产高值类胡萝卜素及多用途生物炼制提供了理论和应用参考，同时提示需权衡代谢工程对经济性状的影响。