Development of rubber-enriched dandelion varieties by metabolic engineering of the inulin pathway
- 作者
- Anna Stolze, Alan Wanke, Nicole van Deenen, Roland Geyer, Dirk Prüfer, Christian Schulze Gronover
- 单位
- University of Muenster, Institute of Plant Biology and Biotechnology; numares AG; Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology (IME)
- 杂志
- Plant Biotechnology Journal（2017）
- DOI
- 10.1111/pbi.12672
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然橡胶需求日益增长，而主要来源橡胶树供应受限，需开发替代可持续来源；俄罗斯蒲公英（Taraxacum koksaghyz）可产胶但其天然橡胶含量有待提高，以满足商业化要求。
研究策略
克隆并功能鉴定蒲公英菊粉代谢关键酶果聚糖1-外水解酶（1-FEH），通过农杆菌介导的遗传转化在两种蒲公英（T. koksaghyz和T. brevicorniculatum）中组成型过表达Tk1-FEH，促进根部菊粉降解，释放游离糖以增强异戊二烯代谢，从而提高天然橡胶含量，并对转基因植株进行代谢组和基因表达分析。
核心内容
针对天然橡胶树供应受限的问题，该研究通过代谢工程改造蒲公英菊粉代谢通路以提高根部天然橡胶含量。研究克隆了俄罗斯蒲公英的果聚糖1-外水解酶基因Tk1-FEH，并通过农杆菌介导法在两种蒲公英中组成型过表达。体外实验证实重组Tk1-FEH最适pH为5.1，可转化27%的菊粉且对蔗糖无活性。在短角蒲公英品系Tb1.2中，橡胶含量从野生型的不超过4 mg/g DW提升至约10 mg/g DW，同时菊粉从315降至125 mg/g DW，聚合度从11降至4；在俄罗斯蒲公英品系Tk8.1中，橡胶含量高达80 mg/g DW，较对照的32.6 mg/g DW近乎翻倍，蔗糖水平也从15升至27 mg/g DW。代谢分析显示过表达1-FEH上调了CPT、RTA和REF等橡胶合成基因，并提高了甾醇和五环三萜含量，而植物生长、开花和种子结实等农艺性状未受影响。该研究首次证明菊粉降解释放的碳流可被重新导向用于橡胶和异戊二烯合成，为培育富橡胶蒲公英工业品种提供了可行策略，1-FEH表达水平和菊粉含量可作为优良品系的选育标记。
创新点
['首次证明菊粉降解提供的能量可被重新导向用于蒲公英天然橡胶合成', '通过组成型过表达Tk1-FEH使橡胶含量近乎翻倍，且在T. koksaghyz中最高达80 mg/g DW', '过表达Tk1-FEH不影响植物生长、开花、种子结实和发芽等农艺性状', '提出利用1-FEH表达水平和菊粉含量作为选育高橡胶蒲公英品种的生化与遗传标记']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taraxacum koksaghyz（俄罗斯蒲公英） | 菊粉代谢通路 | Tk1-FEH | 果聚糖1-外水解酶（Tk1-FEH） | 催化 | 组成型过表达，降解菊粉产生果糖和蔗糖 |
| Taraxacum brevicorniculatum（短角蒲公英） | 菊粉代谢通路 | Tk1-FEH（异源表达） | 果聚糖1-外水解酶（Tk1-FEH） | 催化 | 来自T. koksaghyz的1-FEH在T. brevicorniculatum中过表达 |
| Taraxacum koksaghyz | 菊粉代谢通路 | Tk1-SST | 蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST） | 催化 | 参与菊粉合成，表达随季节变化 |
| Taraxacum koksaghyz | 菊粉代谢通路 | Tk1-FFT | 果聚糖：果聚糖1-果糖基转移酶（1-FFT） | 催化 | 参与菊粉链延伸 |
| Taraxacum brevicorniculatum | 菊粉代谢通路 | Tb1-SST | 蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶（1-SST） | 催化 | 克隆自T. brevicorniculatum |
| Taraxacum brevicorniculatum | 菊粉代谢通路 | Tb1-FFT | 果聚糖：果聚糖1-果糖基转移酶（1-FFT） | 催化 | 克隆自T. brevicorniculatum |
| Taraxacum brevicorniculatum | 天然橡胶生物合成通路 | TbCPT | 橡胶顺式异戊二烯转移酶（CPT） | 催化 | 橡胶链延伸关键酶，过表达1-FEH后表达上调 |
| Taraxacum koksaghyz | 天然橡胶生物合成通路 | TkCPT | 橡胶顺式异戊二烯转移酶（CPT） | 催化 | 橡胶链延伸关键酶，过表达1-FEH后表达上调 |
| Taraxacum brevicorniculatum | 天然橡胶生物合成通路 | TbRTA | 橡胶转移酶激活因子（RTA） | 调控 | 增强CPT活性，过表达1-FEH后表达上调 |
| Taraxacum koksaghyz | 天然橡胶生物合成通路 | TkRTA | 橡胶转移酶激活因子（RTA） | 调控 | 增强CPT活性，过表达1-FEH后表达上调 |
| Taraxacum brevicorniculatum | 天然橡胶生物合成通路 | TbREF | 橡胶延长因子（REF） | 调控 | 橡胶颗粒稳定蛋白，促进橡胶生物合成，过表达1-FEH后表达上调 |
| Taraxacum koksaghyz | 天然橡胶生物合成通路 | TkREF | 橡胶延长因子（REF） | 调控 | 橡胶颗粒稳定蛋白，促进橡胶生物合成，过表达1-FEH后表达上调 |
| Pichia pastoris（毕赤酵母） | 异源蛋白表达 | Tk1-FEH | 果聚糖1-外水解酶（Tk1-FEH） | 催化 | 用于体外功能验证，重组蛋白经PNGase F处理后分子量约63 kDa |
关键发现
- 在T. brevicorniculatum中，过表达Tk1-FEH的品系Tb1.2橡胶含量约10 mg/g DW，而野生型≤4 mg/g DW
- T. koksaghyz品系Tk8.1橡胶含量达80 mg/g DW，对照Tk3.1为32.6 mg/g DW。菊粉含量在Tb1.2中降至125 mg/g DW（野生型315 mg/g DW），平均聚合度从11降至4
- T. koksaghyz品系Tk8.1中蔗糖水平达27 mg/g DW（对照15 mg/g DW）。体外实验显示重组Tk1-FEH最适pH为5.1，可转化27%的菊粉（DP≈21），对蔗糖无活性，8.8 mM蔗糖将菊粉转化率抑制至65%，88 mM蔗糖抑制至15%。此外，过表达1-FEH引起橡胶合成基因CPT、RTA和REF表达上调，并显著提高甾醇和五环三萜含量。
研究结论
通过代谢工程过表达Tk1-FEH，促进菊粉降解并重新分配碳流至天然橡胶和异戊二烯合成，可在不影响植物适应性的情况下显著提高蒲公英根中橡胶含量，为培育富橡胶蒲公英品种用于工业天然橡胶生产提供了可行策略和选育标记。