Developing a Nicotiana benthamiana transgenic platform for high value diterpene production and candidate gene evaluation
- 作者
- Edith C.F. Forestier, Tomasz Czechowski, Amy C. Cording, Alison D. Gilday, Andrew J. King, Geoffrey D. Brown, Ian A. Graham
- 单位
- Centre for Novel Agricultural Products, Department of Biology, University of York; Department of Chemistry, University of Reading
- 杂志
- Plant Biotechnology Journal（2021）
- DOI
- 10.1111/pbi.13574
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
高价值二萜类化合物在天然宿主中含量低、化学合成困难，缺乏可持续的生产平台；同时复杂二萜生物合成途径中的后修饰酶基因功能尚未阐明。
研究策略
利用瞬时表达系统筛选拟南芥MEP途径中可提高GGPP供应的关键基因组合，结合MoClo多基因组装技术构建单载体多基因表达系统，稳定转化本氏烟草生产casbene及衍生物jolkinol C，并以该稳定转化株系为平台瞬时表达候选基因进行功能鉴定。
核心内容
本研究旨在构建本氏烟草稳定转化平台，以解决高价值二萜类化合物天然含量低、化学合成难的问题，并用于复杂二萜生物合成途径中后修饰酶基因的功能鉴定。研究者首先利用瞬时表达系统筛选拟南芥MEP途径中可提升GGPP供应的关键基因组合，结合MoClo多基因组装技术构建单载体多基因表达系统，稳定转化本氏烟草生产casbene及其衍生物jolkinol C。结果显示，AtDXS、AtHDR与AtGGPPS组合可使casbene产量比单独表达JCCAS提高410%，其中AtHDR贡献140%；MoClo三基因载体与35S-JCCAS瞬时共表达获得最高casbene产量3.9 μg/mg DW，比单独35S-JCCAS提高485%。在稳定转化中，18个单转化株系均未检测到jolkinol C，但共转化株系中15个可检测到该化合物。最终建立了稳定产jolkinol C的纯合株系NbJolK-C，并利用该平台瞬时表达烯醛还原酶3类似基因，成功产生12,13-二氢-jolkinol C和12,13-二氢-epi-jolkinol C两种新化合物，证实该酶催化C12-C13双键还原。该研究不仅证明稳定转化复杂二萜时优化前体供应至关重要，也为解析ingenol mebutate等药物的生物合成途径及异源生产奠定了平台基础。
创新点
首次证明AtDXS、AtHDR与AtGGPPS组合可将casbene产量提高410%；建立了稳定产jolkinol C的本氏烟草纯合株系NbJolK-C，并利用该平台鉴定出一种可还原jolkinol C C12-C13双键的烯醛还原酶3类似基因。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | MEP途径/二萜生物合成 | AtDXS | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | MEP途径第一个限速酶，单独过表达即可提高casbene产量 |
| Nicotiana benthamiana | MEP途径 | AtHDR | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 (HDR) | 催化 | 与AtDXS、AtGGPPS组合贡献casbene产量140%的增加 |
| Nicotiana benthamiana | MEP途径/二萜前体合成 | AtGGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 (GGPPS) | 催化 | 催化GGPP合成，是二萜前体 |
| Nicotiana benthamiana | casbene合成 | JcCAS | casbene合酶 (CAS) | 催化 | 催化GGPP环化生成casbene |
| Nicotiana benthamiana | jolkinol C合成 | JCCYP726A20 | 细胞色素P450酶 (CYP726A20) | 催化 | 催化casbene氧化，与CYP71D495共同作用生成jolkinol C前体 |
| Nicotiana benthamiana | jolkinol C合成 | JCCYP71D495 | 细胞色素P450酶 (CYP71D495) | 催化 | 催化casbene氧化，不完全氧化时产生6,9-二羟基-5-酮基casbene |
| Nicotiana benthamiana (NbJolK-C株系) | jolkinol C修饰 | alkenal reductase 3-like | 烯醛还原酶3类似蛋白/双键还原酶 | 催化 | 还原jolkinol C和epi-jolkinol C的C12-C13双键，生成12,13-二氢衍生物 |
关键发现
- AtDXS和AtHDR与AtGGPPS及JCCAS组合使casbene产量比单独表达JCCAS提高410%，其中AtHDR贡献140%
- MoClo三基因载体（A组启动子）与35S-JCCAS瞬时共表达获得最高casbene产量3.9 μg/mg DW，比单独35S-JCCAS提高485%
- 18个单转化稳定株系均未检测到jolkinol C，但A-CP单转化株系中积累了中间体6,9-二羟基-5-酮基casbene
- 27个共转化T0株系中15个可检测到jolkinol，其中B-2/A-CP组合15个中有13个阳性
- 利用NbJolK-C平台瞬时表达烯醛还原酶3类似基因，产生了12,13-二氢-jolkinol C和12,13-二氢-epi-jolkinol C两种新化合物，证实该酶催化C12-C13双键还原。
研究结论
在稳定转化生产复杂二萜时，优化前体供应至关重要；构建的jolkinol C稳定生产平台可高效用于候选基因功能鉴定，为解析ingenol mebutate和tigilanol tiglate等药物的生物合成途径及异源生产奠定基础。