Identification and genome organization of saponin pathway genes from a wild crucifer, and their use for transient production of saponins in Nicotiana benthamiana
- 作者
- Bekzod Khakimov, Vera Kuzina, Pernille Ø. Erthmann, Ery Odette Fukushima, Jörg M. Augustin, Carl Erik Olsen, Jelle Scholtalbers, Hanne Volpin, Sven Bode Andersen, Thure P. Hauser, Toshiya Muranaka, Søren Bak
- 单位
- Department of Plant and Environmental Sciences, Copenhagen Plant Science Center, University of Copenhagen, Thorvaldsensvej 40, Frederiksberg CDK-1871, Denmark; Department of Food Science, University of Copenhagen, Rolighedsvej 26, Frederiksberg DK-1958, Denmark; Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University, Suita Osaka 565-0871, Japan; EMBL, Heidelberg, Germany; Keygene, Agro Business Park 90, Wageningen 6708 PW, The Netherlands; Danziger Innovations, Mishmar HaShiva 5029700, Israel
- 杂志
- The Plant Journal（2015）
- DOI
- 10.1111/tpj.13012
- 所属领域
- 代谢工程、合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定野生十字花科植物Barbarea vulgaris中参与皂苷生物合成的关键基因，揭示其基因组组织与进化机制，并利用合成生物学在异源宿主中瞬时生产皂苷类化合物。
研究策略
结合遗传连锁图谱与QTL分析、转录组和基因组测序、系统发育分析、异源表达（酿酒酵母和本氏烟草）及GC-MS/LC-MS代谢物分析，通过CPMV-HT技术组合表达多个皂苷途径基因，重建皂苷生物合成。
核心内容
本研究从野生十字花科植物Barbarea vulgaris中鉴定并解析了三萜皂苷生物合成途径的关键基因及其基因组组织特征。通过遗传连锁图谱、QTL分析、转录组与基因组测序相结合，克隆了两个新的2,3-氧化鲨烯环化酶LUP2和LUP5，以及两个CYP716A家族P450酶（CYP716A80/81）。功能表征显示，LUP5G主要产生β-amyrin（78%），而LUP5P同时产生β-amyrin（36%）和α-amyrin；CYP716A80/81可催化β-amyrin C28位氧化生成oleanolic acid。基因定位分析表明这些皂苷合成基因不聚类，而是分散在不同连锁群上。利用CPMV-HT瞬时表达系统在本氏烟草中共表达LUP5G、CYP716A80和UGT73C11，成功实现了oleanolic acid及其3-O-单葡萄糖苷的从头合成，oleanolic acid占总产物70%以上，并检测到多达29个推定皂苷，糖基数目从1到6个己糖不等。研究发现G型和P型化学型的抗虫差异主要由OSC基因的差异表达决定，而非基因本身的功能分化。该工作证明了在异源宿主中重建多样化三萜皂苷生物合成的可行性，为作物抗虫育种和皂苷类药物生产提供了基础。
创新点
1. 鉴定了两个新的2,3-氧化鲨烯环化酶（LUP2和LUP5）和两个CYP716A P450（CYP716A80/81），并揭示了G型和P型之间的功能差异；2. 证明皂苷生物合成基因在基因组中不聚类，而是位于不同连锁群；3. 利用CPMV-HT在烟草中瞬时共表达多个基因，成功产生了oleanolic acid和3-O-oleanolic acid monoglucoside等皂苷，并发现烟草可进一步将单葡萄糖苷糖基化为多达六个己糖的皂苷。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | LUP5G | LUP5G | 催化 | 来自B. vulgaris G型的2,3-氧化鲨烯环化酶，主要产生β-amyrin（78%），另有少量α-amyrin和lupel。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | LUP5P | LUP5P | 催化 | 来自P型的同工酶，产物中β-amyrin占36%，α-amyrin为主要产物之一，与G型产物比例不同。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | LUP2G | LUP2G | 催化 | 来自G型的环化酶，主要产生lupel（>90%）。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | LUP2P | LUP2P | 催化 | 来自P型的环化酶，产物以lupel为主，与LUP2G类似。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | CYP716A80 | CYP716A80 | 催化 | 来自G型的细胞色素P450，催化β-amyrin C28氧化为oleanolic acid，也氧化α-amyrin和lupel为相应酸；产物特异性较高。亦在Saccharomyces cerevisiae中表达。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | CYP716A81 | CYP716A81 | 催化 | 来自P型的P450，与CYP716A80有95%氨基酸同一性，但产物特异性较低，产生更多未知氧化产物。亦在Saccharomyces cerevisiae中表达。 |
| Barbarea vulgaris | 三萜皂苷生物合成 | CYP72A (候选) | CYP72A | 催化 | 与抗性QTL共定位的候选P450基因，推测参与皂苷骨架的氧化修饰，但未完成功能验证。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | UGT73C11 | UGT73C11 | 催化 | 来自G型的UDP-糖基转移酶，特异性催化皂苷元C3位葡萄糖基化，不作用C28。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | UGT73C10 | UGT73C10 | 催化 | 来自P型的直系同源酶，与UGT73C11有98%同一性，生化性质相似。 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜皂苷生物合成 | UGT73C13 | UGT73C13 | 催化 | 非特异性糖基转移酶，可同时糖基化C3和C28位。 |
关键发现
- LUP5G主要产生β-amyrin（78%），而LUP5P产生β-amyrin（36%）和α-amyrin；LUP2主要产生lupel（>90%）。
- CYP716A80/81催化β-amyrin C28氧化产生oleanolic acid和erythrodiol，但CYP716A80的产物以oleanolic acid为主，CYP716A81则产生更多副产物。
- 在N. benthamiana中共表达LUP5G+CYP716A80+UGT73C11时，oleanolic acid为主要产物（>70%），并积累oleanolic acid 3-O-glucoside；共表达LUP2P+CYP716A81+UGT73C11时，主要产生未知4的3-O-单葡萄糖苷（51%）。
- 共检测到29个推定皂苷，其中LUP5G组合产生22个，LUP2P组合产生16个，糖基数目从1到6个己糖。
- 皂化实验表明C3和C28位均发生糖基化。
- 基因表达分析显示，G型叶片中LUP5表达水平较高，而P型叶片中LUP2表达水平较高；CYP716A80在G型中的表达高于CYP716A81在P型中的表达。
研究结论
Barbarea属中皂苷生物合成的进化源于UDP-糖基转移酶的新功能化，而G型和P型化学型之间的昆虫抗性差异主要由OSC（LUP5和LUP2）的差异表达决定。通过合成生物学在烟草中成功重建了部分皂苷生物合成，证明了生产多样化三萜皂苷的可行性，为作物抗虫育种和药物生产提供了基础。