A BAHd acyltransferase catalyzing 19-O-acetylation of tabersonine derivatives in roots of Catharanthus roseus enables combinatorial synthesis of monoterpene indole alkaloids
- 作者
- Inés Carqueijeiro, Thomas Dugé de Bernonville, Arnaud Lanoue, Thu-Thuy Dang, Christiana N Teijaro, Christian Paetz, Kevin Billet, Angela Mosquera, Audrey Oudin, Sébastien Besseau, Nicolas Papon, Gaëlle Glevarec, Lucia Atehortua, Marc Clastre, Nathalie Giglioli-Guivarc'h, Bernd Schneider, Benoit St-Pierre, Rodrigo B. Andrade, Sarah E. O'Connor, Vincent Courdavault
- 单位
- EA2106 'Biomolécules et Biotechnologies Végétales', Université de Tours, Tours, France; Department of Biological Chemistry, The John Innes Centre, Norwich NR4 7UH, UK; Department of Chemistry, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania 19122, USA; Max-Planck-Institute for Chemical Ecology, Beutenberg Campus, Hans-Knöll-Str. 8, D-07745 Jena, Germany; Laboratorio de Biotecnologia, Universidad de Antioquia, Sede de Investigación Universitaria, Medellín, Colombia; EA3142 'Groupe d'Etude des Interactions Hôte-Pathogène', Université d'Angers, Angers, France
- 杂志
- The Plant Journal（2018）
- DOI
- 10.1111/tpj.13868
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花根中它波宁衍生物的19-O-乙酰化反应原先归因于MAT，但MAT在体内活性极低，因此需重新鉴定真正催化该反应的BAHD酰基转移酶，并实现根型单萜吲哚生物碱的异源组合合成。
研究策略
通过转录组测序和与T19H的共表达相关性分析筛选根中BAHD候选基因，在酵母中异源表达并筛选活性；对鉴定到的TAT进行酶动力学、亚细胞定位、本氏烟草表达验证；最后将TAT与叶部修饰酶（T16H2、16OMT、T3O）组合在酵母中合成非天然单萜吲哚生物碱。
核心内容
本研究通过转录组测序与共表达分析，从长春花根中筛选并鉴定了一个新的BAHD家族酰基转移酶TAT，负责催化它波宁衍生物的19-O-乙酰化反应。在酵母中异源表达后，TAT对minovincinine的Km为9 μM，催化效率较此前归因的MAT高出20至200倍，而MAT在酵母和植物体内均未表现出直接乙酰化活性，表明其可能仅起次要或间接作用。进一步将TAT与叶部修饰酶T16H2、16OMT及T19H在酵母中组合表达，成功将它波宁转化为非天然的16-甲氧基-19-乙酰它波宁，最终转化量约占起始底物的10%，约106 μg/g DW；在本氏烟草叶片中也仅TAT具有乙酰化活性。该研究纠正了长春花根中19-O-乙酰化反应的酶学归属，并建立了一个以TAT为核心的模块化酵母组合生物合成平台，为单萜吲哚生物碱的异源生产与结构多样化提供了新的酶学工具和代谢工程策略。
创新点
鉴定到TAT（tabersonine derivative 19-O-acetyltransferase）为根中真正的19-O-乙酰转移酶，其催化效率比MAT高20-200倍；证明MAT在酵母和植物体内无直接乙酰化活性；建立了基于TAT的酵母组合生物合成平台，成功合成新化合物16-甲氧基-19-乙酰它波宁等。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 WAT11 | 单萜吲哚生物碱生物合成 | T19H | tabersonine 19-hydroxylase (CYP71BJ1) | 催化 | 催化它波宁C19位羟基化，锚定内质网 |
| 酿酒酵母 WAT11 | 单萜吲哚生物碱生物合成（根型） | TAT (CRO_T005215) | tabersonine derivative 19-O-acetyltransferase | 催化 | 催化19-O-乙酰化，体外催化效率比MAT高20-200倍；也表达于本氏烟草和E. coli |
| 酿酒酵母 WAT11 | 单萜吲哚生物碱生物合成（根型） | MAT (CRO_T005213) | minovincinine 19-hydroxy-O-acetyltransferase | 催化 | 体外活性低，体内无直接乙酰化活性 |
| 酿酒酵母 WAT11 | vindoline生物合成途径 | T16H2 | tabersonine 16-hydroxylase (CYP71D351) | 催化 | 催化它波宁C16位羟化 |
| 酿酒酵母 WAT11 | vindoline生物合成途径 | 16OMT | 16-hydroxytabersonine 16-O-methyltransferase | 催化 | 催化C16位甲氧基化 |
| 酿酒酵母 WAT11 | vindoline生物合成途径 | T3O | tabersonine 3-oxidase | 催化 | 催化C2-C3环氧化 |
| 酿酒酵母 WAT11 | vindoline生物合成途径 | DAT (CRO_T020280) | deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase | 催化 | 叶部酶，催化去乙酰长春碱4-O-乙酰化 |
关键发现
- TAT在酵母中能高效乙酰化19-羟基它波宁衍生物（minovincinine、hörhammericine等），而MAT无活性。重组TAT对minovincinine的Km为9 μM，kcat/Km为1.47×10^5 s^-1 M^-1
- 对hörhammericine的Km为58 μM，kcat/Km为3.9×10^3 s^-1 M^-1
- 对19-羟基它波宁的Km为78 μM，kcat/Km为1.7×10^5 s^-1 M^-1
- MAT对应kcat/Km分别为710、47和6.5×10^3 s^-1 M^-1。TAT和MAT只利用乙酰-CoA作为酰基供体，不能接受苯甲酰-CoA等其他酰基-CoA。组合表达T16H2、16OMT、T19H和TAT于酵母中，可将它波宁转化为16-甲氧基-19-乙酰它波宁，最终转化量约占起始它波宁的10%，约106±20 μg/g DW。在N. benthamiana叶片中，仅TAT-GFP能乙酰化minovincinine，MAT-GFP无活性。
研究结论
TAT是长春花根中催化它波宁衍生物19-O-乙酰化的关键酶，MAT可能仅有次要或间接作用；TAT可作为模块化工具用于酵母中合成非天然单萜吲哚生物碱，为MIA代谢工程提供新策略。