High-throughput mapping of CoA metabolites by SAMDI-MS to optimize the cell-free biosynthesis of HMG-CoA
- 作者
- Patrick T. O'Kane, Quentin M. Dudley, Aislinn K. McMillan, Michael C. Jewett, Milan Mrksich
- 杂志
- Science Advances（2019）
- DOI
- 10.1126/sciadv.aaw9180
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
CoA依赖代谢途径中，中间体和终产物的定量分析方法通量低（如色谱-质谱需15分钟以上/样），限制了代谢途径的工程化优化速度。
研究策略
开发了基于SAMDI-MS的检测方法：利用N端半胱氨酸肽通过转硫酯化反应共价捕获CoA-硫酯代谢物，再将肽-代谢物偶联物通过马来酰亚胺基团固定在自组装单分子层阵列上，用MALDI-TOF MS直接定量。结合384孔板与液体处理机器人，实现数千条件并行测定。
研究路线图
核心内容
该研究开发了一种基于SAMDI-MS的高通量检测方法，以加速无细胞体系中HMG-CoA生物合成途径的优化。研究者利用N端半胱氨酸肽通过转硫酯化反应选择性捕获CoA-硫酯代谢物，并将其固定于自组装单分子层阵列上，结合MALDI-TOF MS实现多种CoA代谢物的同时定量。通过384孔板和液体处理机器人，在768种辅因子条件下收集超过9000个光谱，对乙酰-CoA、HMG-CoA和G3P进行高通量映射。结果显示，乙酸体系中HMG-CoA最高产量平均为6.4±0.5 mM，谷氨酸体系为2.6±0.1 mM，检测限低至5 μM；同位素示踪表明葡萄糖碳源贡献在乙酸体系中约占5%、谷氨酸体系中约占22%。研究还发现CoA与ATP比例影响产物分布，且未检测到AA-CoA积累。该方法实现了对复杂裂解液中多种CoA代谢物的快速并行定量与代谢流追踪，为无细胞代谢途径的工程化优化提供了通用且可扩展的高通量分析工具。
创新点
1. 将NCL（天然化学连接）化学应用于CoA代谢物的选择性捕获；2. 用SAMDI-MS实现复杂裂解液中多种CoA代谢物的同时检测与定量；3. 结合同位素标记追踪碳源流向；4. 实现768种辅因子条件下超9000个光谱的高通量映射。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | HMG-CoA生物合成（乙酰-CoA到HMG-CoA） | ACAT (pETBCS-ACAT(Eco)) | Ac-CoA acetyltransferase | 催化 | 催化乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA（AA-CoA），但实验显示该酶倾向于逆反应，AA-CoA不积累。 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（异源表达） | HMG-CoA生物合成（乙酰-CoA到HMG-CoA） | HMGS (pETBCS-HMGS(Sce)) | HMG-CoA synthase | 催化 | 来自酿酒酵母，催化AA-CoA与乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA。 |
| Escherichia coli BL21(DE3)（无细胞体系） | 糖酵解（G3P/DHAP互变及副产物形成） | tpiA | triosephosphate isomerase | 催化 | 催化G3P与DHAP互变，并导致副产物甲基乙二醛（pyruvaldehyde）形成，后者被捕获为N-乳酰肽或醛醇缩合产物。 |
关键发现
- 论文收集超过10,000个个体光谱，映射超过800个独特反应条件；在768种辅因子条件下对Ac-CoA、HMG-CoA和G3P进行定量。乙酸盐体系中HMG-CoA最高产量平均为6.4 ±
- 5 mM，谷氨酸盐体系为2.6 ±
- 1 mM；HMG-CoA检测限低至5 μM；两种盐体系均达到约600 μM HMG-CoA（初始1 mM辅因子条件）；在最佳条件下，葡萄糖碳源贡献在乙酸体系中约占5%，谷氨酸体系中约占22%；当CoA浓度低而ATP高时，G3P为主要产物；在谷氨酸体系，CoA 4 mM时HMG产量达到峰值，更高CoA需更高NAD+和ATP维持产量；未观察到AA-CoA积累，因为ACAT偏向逆反应。
研究结论
本研究建立了一种通用、可扩展的SAMDI-MS高通量方法，可同时定量多种CoA代谢物并追踪代谢流，极大加速无细胞代谢途径的优化，为代谢工程提供高通量分析工具。