De Novo Transcriptome Analysis of Plant Pathogenic Fungus Myrothecium roridum and Identification of Genes Associated with Trichothecene Mycotoxin Biosynthesis
- 作者
- Wei Ye, Taomei Liu, Muzi Zhu, Weimin Zhang, Haohua Li, Zilei Huang, Saini Li
- 单位
- State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangdong Institute of Microbiology
- 杂志
- International Journal of Molecular Sciences（2017）
- DOI
- 10.3390/ijms18030497
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物病原真菌 Myrothecium roridum 的致病机制尚不清楚，缺乏其转录组信息，且 trichothecene 毒素生物合成相关基因尚未被完整鉴定。
研究策略
利用 Illumina HiSeq 2000 对 M. roridum 不同培养时间的转录组进行测序和 de novo 组装，通过功能注释和 KEGG 通路分析鉴定 trichothecene 生物合成候选基因，用 qRT-PCR 验证表达；克隆表达 Tri4、Tri5、Tri11 基因并纯化重组蛋白，进行酶学性质测定和 GC-MS 产物分析，构建系统发育树和蛋白互作网络。
核心内容
本研究对植物病原真菌Myrothecium roridum A553进行了Illumina HiSeq 2000转录组测序，获得了约8.0 Gb数据，通过de novo组装得到35,485条转录本和25,996条unigenes，平均长度1094 bp，其中18,199个unigenes获得功能注释，并鉴定出2200个含SSR的unigenes。经功能注释和KEGG通路分析，系统鉴定了trichothecene生物合成相关候选基因，其中Tri5表达量最高，Tri12和Tri6次之。将该基因簇中的Tri5、Tri4和Tri11分别在大肠杆菌中克隆表达并纯化重组蛋白：Tri5编码的trichodiene synthase纯度为91.9%，催化FPP生成β-farnesene、nerolidol和farnesol，其中nerolidol占比68.2%；Tri4编码的单加氧酶TRO-MR在30°C、pH 8.8下对thioanisole的最高酶活为11.26±1.53 U/mg；Tri11编码的C-15羟化酶ITH-MR在25°C、pH 8.8下最高酶活达31.0±0.6 U/mg，其Vmax为94.34 μmol/mg·min，Km为7.19 mM。系统发育分析显示该菌trichodiene synthase与其他物种相似性最高仅26%，并发现MAPK信号通路（54个unigenes）可能参与致病性调控。该研究首次提供M. roridum完整转录组资源，为阐明其致病分子机制和毒素合成调控奠定了重要基础。
创新点
首次获得 M. roridum 的完整转录组并组装出 25,996 个 unigenes；克隆表达了 Tri4、Tri5、Tri11 基因并表征了酶学性质；发现 M. roridum 的 trichodiene synthase 与其他物种相似性极低（最高仅 26%），并揭示了 MAPK 信号通路在 M. roridum 致病性中的潜在作用。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Myrothecium roridum A553 | trichothecene biosynthesis | Tri5 | trichodiene synthase | 催化 | 将法尼基焦磷酸（FPP）环化为 trichodiene，是 trichothecene 生物合成的关键酶；表达量最高，催化产物中 nerolidol 占 68.2%。 |
| Myrothecium roridum A553 | trichothecene biosynthesis | Tri4 | trichodiene oxygenase (TRO-MR) | 催化 | 催化 trichodiene 的氧化反应；最适温度 30°C，最适 pH 8.8，对 thioanisole 的最高酶活为 11.26±1.53 U/mg。 |
| Myrothecium roridum A553 | trichothecene biosynthesis | Tri11 | isothiocdermin C-15 hydroxylase (ITH-MR) | 催化 | 催化 C-15 位羟基化；最适温度 25°C，最适 pH 8.8，对 thioanisole 的最高酶活为 31.0±0.6 U/mg，底物亲和力高于 TRO-MR。 |
| Myrothecium roridum A553 | trichothecene biosynthesis | Tri6 | trichothecene biosynthesis transcription factor | 调控 | 转录调控因子，表达量仅次于 Tri5，推测调控 trichothecene 生物合成。 |
| Myrothecium roridum A553 | trichothecene biosynthesis | Tri3 | trichothecene 3-O-acetyltransferase | 催化 | 参与 trichothecene 的乙酰化修饰。 |
| Myrothecium roridum A553 | trichothecene biosynthesis | Tri12 | trichothecene efflux pump | 转运 | 膜转运蛋白，负责 trichothecene 毒素的外排，表达量仅次于 Tri5。 |
| Myrothecium roridum A553 | MAPK signaling pathway | CDC42 | CDC42 GTP-binding protein | 调控 | MAPK 信号通路核心蛋白之一，可能与致病性相关。 |
| Myrothecium roridum A553 | MAPK signaling pathway | SEC23 | transport protein SEC23 | 转运 | MAPK 信号通路相关蛋白，可能参与致病过程。 |
| Myrothecium roridum A553 | ribosome biogenesis | c10594 | U3 small nucleolar RNA-associated protein 7 | 调控 | 核糖体生物发生网络中心节点，可能影响生长和毒力。 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | heterologous expression | Tri5 | trichodiene synthase | 催化 | 用于异源表达并纯化，纯度达 91.9%。 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | heterologous expression | Tri4 | trichodiene oxygenase | 催化 | 异源表达纯化后纯度达 92.5%。 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | heterologous expression | Tri11 | isothiocdermin C-15 hydroxylase | 催化 | 异源表达纯化后纯度达 95.7%。 |
关键发现
- 转录组测序共获得 44,992,952 条 reads（约
- 0 Gb），组装得到 35,485 条 transcripts 和 25,996 条 unigenes（平均长度 1094 bp）；18,199 个 unigenes 获得功能注释。Tri5 基因表达量最高，Tri12、Tri6 次之。Tri5 编码的 trichodiene synthase 纯度为
- 9%，催化 FPP 产生 β-farnesene、nerolidol 和 farnesol，其中 nerolidol 占
- 2%。Tri4 编码的 trichodiene oxygenase（TRO-MR）纯度为
- 5%，在 30°C、pH
- 8 下对 thioanisole 的最高酶活为
- 26±1.53 U/mg；Tri11 编码的 isothiocdermin C-15 hydroxylase（ITH-MR）纯度为
- 7%，在 25°C、pH
- 8 下最高酶活为
- 0±0.6 U/mg。酶动力学测定显示 ITH-MR 的 Vmax 为
- 34 μmol/mg·min、Km 为
- 19 mM，TRO-MR 的 Vmax 为
- 43 μmol/mg·min、Km 为
- 53 mM。SSR 分析发现 2200 个 unigenes 含有 SSR，其中单核苷酸重复占
- 68%。系统发育分析显示 M. roridum 的 trichodiene synthase 与 Fusarium sporotrichioides 的相似性最高仅 26%。MAPK 信号通路涉及 54 个 unigenes，核糖体生物发生涉及 17 个 unigenes。
研究结论
本研究首次完成 M. roridum 的转录组测序，系统鉴定了 trichothecene 生物合成相关基因，证实 Tri5 在 trichothecene 毒素合成中发挥关键作用，Tri4 和 Tri11 编码的酶具有单加氧酶功能，并推测 MAPK 信号通路参与致病性。这些结果为阐明 M. roridum 的致病分子机制及通过遗传工程手段防治其危害奠定了基础。