Construction of a Soluble Adenylyl Cyclase Activated by Gα and Forskolin
- 作者
- Wei-Jen Tang, Alfred G. Gilman
- 单位
- Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75235, USA; Department of Pharmacological and Physiological Sciences, University of Chicago, Chicago, IL 60637, USA
- 杂志
- Science（1995）
- DOI
- 10.1126/science.7792604
- 所属领域
- 蛋白质工程
- 关键词
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解决的核心问题
膜结合型腺苷酸环化酶难以表达纯化且不稳定，需构建可溶性且保留调控功能的研究工具
研究策略
将I型腺苷酸环化酶的C1a胞质域与II型腺苷酸环化酶的C2a胞质域通过不同长度连接肽融合，构建嵌合基因，在大肠杆菌中表达并用体内/体外活性分析验证
核心内容
该研究将哺乳动物I型腺苷酸环化酶的C1a胞质域与II型腺苷酸环化酶的C2a胞质域通过不同长度连接肽融合，构建了可溶性嵌合腺苷酸环化酶IC1IIC2，并在大肠杆菌Δcya菌株中表达。纯化的嵌合酶约60 kD，基础活性约2 pmol/min/mg，但可被Gsα和forskolin协同激活：200 nM GTP-γ-S-Gsα单独激活50倍，100 μM forskolin激活150至200倍，两者联合激活可达600倍，活性超过1 nmol/min/mg。动力学分析显示forskolin的EC50约为7 μM，Gsα的EC50约为1 μM，ATP的Km在两种激活条件下分别为0.44 mM和0.11 mM。凝胶过滤显示蛋白主要以单体形式存在，P位抑制剂可非竞争性抑制其活性，而Ca2+/钙调蛋白无影响。该研究首次证明跨膜结构域并非哺乳动物腺苷酸环化酶催化和Gsα/forskolin调控所必需，建立的可溶性嵌合酶及大肠杆菌互补系统为G蛋白调控腺苷酸环化酶的遗传筛选和生化研究提供了便利工具。
创新点
首次构建出可被Gsα和forskolin协同激活的可溶性腺苷酸环化酶；证明跨膜螺旋对催化和G蛋白/forskolin调控非必需；建立了可用于遗传筛选的大肠杆菌互补系统
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TP2000 (Δcya) | cAMP生物合成 | I型腺苷酸环化酶C1a结构域编码序列（哺乳动物type I AC） | IC1a（I型腺苷酸环化酶C1a胞质域） | 催化 | 与IIC2a融合构成可溶性嵌合酶，单独不催化 |
| Escherichia coli TP2000 (Δcya) | cAMP生物合成 | II型腺苷酸环化酶C2a结构域编码序列（哺乳动物type II AC） | IIC2a（II型腺苷酸环化酶C2a胞质域） | 催化 | 与IC1a融合构成可溶性嵌合酶，单独活性极低 |
| Escherichia coli TP2000 (Δcya) | cAMP信号通路（G蛋白调控） | Gsα编码基因（GNAS同源） | Gsα（G蛋白α亚基，野生型及组成型激活突变体Gln227→Leu或Arg201→Cys） | 调控 | 激活嵌合腺苷酸环化酶，GTP-γ-S-Gsα可刺激酶活性 |
| Escherichia coli TP2000 (Δcya) | cAMP生物合成 | 嵌合基因（I型C1a + 连接肽 + II型C2a） | IC1IIC2-L1/L3/L5（可溶性嵌合腺苷酸环化酶） | 催化 | 约60 kD；基础活性约2 pmol/min/mg；可被Gsα和forskolin协同激活，最大活性超过1 nmol/min/mg |
关键发现
- 构建的IC1IIC2嵌合酶约60 kD，在大肠杆菌Δcya菌株中表达可恢复cAMP合成
- 可溶性蛋白基础活性约2 pmol/min/mg，200 nM GTP-γ-S-Gsα激活50倍，100 μM forskolin激活150-200倍，两者联合激活600倍，活性可达1 nmol/min/mg以上
- forskolin EC50约7 μM，Gsα EC50约1 μM
- ATP Km分别为0.44 mM（forskolin）和0.11 mM（Gsα）
- 凝胶过滤显示主要单体峰（60 kD）及少量二聚体
- P位抑制剂2'-deoxy-3'-AMP可非竞争性抑制
- Ca2+/钙调蛋白无影响
研究结论
哺乳动物腺苷酸环化酶的跨膜结构域并非催化及Gsα/forskolin调控所必需；该可溶性嵌合酶体系适用于G蛋白调节腺苷酸环化酶的遗传与生化研究