Engineered Respiro-Fermentative Metabolism for the Production of Biofuels and Biochemicals from Fatty Acid-Rich Feedstocks
- 作者
- Clementina Dellomonaco, Carlos Rivera, Paul Campbell, Ramon Gonzalez
- 单位
- Rice University, Department of Chemical and Biomolecular Engineering; Glycos Biotechnologies Inc.; Rice University, Department of Bioengineering
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1128/AEM.00046-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
脂肪酸只能在呼吸代谢条件下被微生物利用，无法支持发酵产物的合成，因此难以直接从脂肪酸类原料高效生产燃料和化学品。
研究策略
以大肠杆菌为底盘，通过引入组成型高表达的fadR*和atoC(Con)突变实现脂肪酸的高效分解代谢，同时工程化多种天然和异源发酵途径（如乙醇、丁醇、乙酸、丙酮、异丙醇、琥珀酸和丙酸合成途径），创建呼吸-发酵代谢模式，使菌株在呼吸代谢脂肪酸的同时合成目标产物。
研究路线图
核心内容
该研究以大肠杆菌为底盘，通过引入组成型高表达的fadR*和atoC(Con)突变解除脂肪酸代谢调控，并结合多种天然及异源发酵途径，成功构建了呼吸-发酵偶联的新型代谢模式，实现了从脂肪酸原料直接生产乙醇、丁醇、乙酸、丙酮、异丙醇、琥珀酸和丙酸等七种产物。理论计算显示，以棕榈酸为底物时各产物理论产率均远超糖类，如乙醇达1.38 g/g，为葡萄糖的2.71倍。实验验证中，过表达耐氧AdhE*的菌株在kLa=6.7 h⁻¹条件下乙醇产率达0.92 g/g棕榈酸，约为糖基理论最大值的2倍，且乙醇和乙酸产率均超过糖类生产的最大理论值。丁醇产量较糖基生产提高2–3倍；琥珀酸经敲除sdhB、sucC、sucD后产率较野生型提升2.3倍；异丙醇产率达0.13 g/g棕榈酸。尤为重要的是，该研究首次在大肠杆菌中实现了丙酸合成（最高产率达理论最大值的8.8%），打破了此前认为仅丙酸菌可合成的认知。这项工作为利用脂肪酸类可再生原料生产生物燃料和化学品奠定了代谢工程基础，拓展了脂肪酸原料的转化途径与应用前景。
创新点
首次在大肠杆菌中实现从脂肪酸到乙醇、丁醇、乙酸、丙酮、异丙醇、琥珀酸和丙酸的生物转化；通过构建呼吸-发酵代谢模式克服了脂肪酸代谢只支持呼吸的限制；乙醇和乙酸产率超过了从糖类生产的最大理论值；首次在大肠杆菌中实现了丙酸的合成（此前认为仅丙酸菌可合成）。
研究对象（26）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 脂肪酸β-氧化 | fadD | 长链脂酰-CoA合成酶 | 催化 | 催化脂肪酸活化为脂酰-CoA |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 脂肪酸β-氧化 | fadE | 脂酰-CoA脱氢酶 | 催化 | β-氧化第一步脱氢 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 脂肪酸β-氧化 | fadB | 烯脂酰-CoA水合酶/3-羟脂酰-CoA脱氢酶 | 催化 | β-氧化双功能酶 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 脂肪酸β-氧化 | fadA | 3-酮脂酰-CoA硫解酶 | 催化 | β-氧化最后一步硫解 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 脂肪酸代谢调控 | fadR | FadR转录调控因子 | 调控 | fadR*突变导致fad regulon组成型表达 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 短链脂肪酸代谢调控 | atoC | AtoC转录调控因子 | 调控 | atoC(Con)突变导致ato operon组成型表达 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 乙醇合成 | adhE | 乙醛/醇脱氢酶AdhE* | 催化 | E568K突变使其在有氧条件下具有高活性 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丁醇合成 | atoB | 乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丁醇合成 | hbd | β-羟基丁酰-CoA脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丁醇合成 | crt | 巴豆酸酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丁醇合成 | bcd | 丁酰-CoA脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丁醇合成 | etfAB | 电子转移黄素蛋白 | 能量供给 | 参与丁酰-CoA脱氢酶的电子传递 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丁醇合成 | adhE2 | 丁醛/丁醇脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum，催化丁酰-CoA生成丁醇 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 乙酸合成 | ackA | 乙酸激酶 | 催化 | 催化乙酰磷酸生成乙酸 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 乙酸合成 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 催化乙酰-CoA生成乙酰磷酸 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丙酮合成 | atoD | 乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶亚基A | 催化 | atoD-atoA共同作用 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丙酮合成 | atoA | 乙酰-CoA:乙酰乙酸-CoA转移酶亚基D | 催化 | atoD-atoA共同作用 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丙酮合成 | adc | 乙酰乙酸脱羧酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum，催化乙酰乙酸生成丙酮 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 异丙醇合成 | sadH | 仲醇脱氢酶 | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum，将丙酮还原为异丙醇 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 琥珀酸代谢 | sdhB | 琥珀酸脱氢酶亚基B | 催化 | 敲除该基因以减少琥珀酸向富马酸转化 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | TCA循环 | sucA | 2-酮戊二酸脱氢酶E1组分 | 催化 | 敲除以减少乙酰-CoA经TCA循环氧化 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | TCA循环 | sucC | 琥珀酰-CoA合成酶β亚基 | 催化 | 敲除以减少乙酰-CoA经TCA循环氧化 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | TCA循环 | sucD | 琥珀酰-CoA合成酶α亚基 | 催化 | 敲除以减少乙酰-CoA经TCA循环氧化 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丙酸合成 | scpA | 甲基丙二酰-CoA变位酶 | 催化 | 来自大肠杆菌scpA-argK-scpB-scpC操纵子 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丙酸合成 | scpB | 甲基丙二酰-CoA脱羧酶 | 催化 | 来自大肠杆菌scpA-argK-scpB-scpC操纵子 |
| Escherichia coli MG1655及其衍生菌株 | 丙酸合成 | scpC | 丙酰-CoA:琥珀酸CoA转移酶 | 催化 | 来自大肠杆菌scpA-argK-scpB-scpC操纵子 |
关键发现
- 理论计算表明：以棕榈酸(C16:0)为底物时，乙醇最大理论产率为1.38 g/g（葡萄糖为0.51 g/g，高2.71倍）、丁醇为1.10 g/g（葡萄糖0.41）、乙酸为2.70 g/g（葡萄糖1.00）、丙酮为1.30 g/g（葡萄糖0.48）、异丙醇为1.20 g/g（葡萄糖0.44）、琥珀酸为2.87 g/g（葡萄糖1.12）、丙酸为1.81 g/g（葡萄糖0.70）。实验结果表明：过表达耐氧AdhE*的MG1655在kLa=6.7 h^-1时乙醇产率达0.92 g/g棕榈酸，约为糖基理论最大值的2倍
- 在fadR*atoC(Con)背景下乙醇产率达到棕榈酸理论最大值的77%。丁醇产量和滴度比文献报道的糖基生产高2-3倍。异丙醇产率在fadR*atoC(Con)菌株中为0.13 g/g棕榈酸，达理论最大值的10.8%
- 琥珀酸经敲除sdhB、sucC、sucD等改造后产率较野生型提高2.3倍，达理论最大值的14.6%
- 丙酸首次在大肠杆菌中合成，最高产率达理论最大值的8.8%。
研究结论
本研究创建的合成呼吸-发酵代谢模式为利用脂肪酸类可再生原料生产生物燃料和化学品奠定了基础，并首次证明大肠杆菌可生产丙酸，拓展了脂肪酸原料的生物转化途径。