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Complex scaffold remodeling in plant triterpene biosynthesis

作者
Ricardo De La Peña, Hannah Hodgson, Jack Chun-Ting Liu, Michael J. Stephenson, Azahara C. Martin, Charlotte Owen, Alex Harkess, Jim Leebens-Mack, Luis E. Jimenez, Anne Osbourn, Elizabeth S. Sattely
单位
Department of Chemical Engineering, Stanford University; Department of Biochemistry and Metabolism, John Innes Centre; Department of Chemistry, Stanford University; School of Chemistry, University of East Anglia; Department of Crop Genetics, John Innes Centre; HudsonAlpha Institute for Biotechnology; Department of Plant Biology, University of Georgia; Howard Hughes Medical Institute, Stanford University
杂志
Science（2023）
DOI
10.1126/science.adf1017
所属领域
代谢工程
关键词
Citrus sinensisMelia azedarachacyltransferasecytochrome P450limonoidsscaffold remodelingtriterpene biosynthesis
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解决的核心问题

植物三萜类化合物中柠檬苦素生物合成所涉及的复杂骨架重构（如C环开环、甲基迁移）的酶促机制尚不清楚，关键酶基因未被鉴定。

研究策略

结合基因组/转录组数据挖掘与共表达分析，从柑橘和楝科植物中筛选候选基因，通过农杆菌介导在本氏烟草中异源表达重构通路，利用LC-MS和NMR鉴定中间体结构，从而解析骨架重构步骤。

研究路线图

100%
研究问题：
柠檬苦素骨架重构
酶促机制不明
策略：基因组/转录组挖掘
+共表达分析筛选
候选基因
关键改造1：
本氏烟草异源表达
重构通路（Cs/Ma基因）
关键改造2：
C-7 O-乙酰化是
C-4断裂前提
关键改造3：
鉴定新型酶：
Baeyer-Villiger开环、
甲基迁移、呋喃环形成
结果1：组装
M. azedarach 基因组
（230 Mbp，14条染色体）
结果2：实现部分通路重构，
NMR鉴定了多个中间体
（apo-melianol等）
结果3：发现MaCYP716AD4/
CsCYP716AD2需C-7乙酰化
底物，否则生成副产物(20)
结论：揭示复杂骨架重构
关键酶促步骤，为三萜
多样性机制提供新见解
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核心内容

本研究通过整合基因组与转录组数据挖掘及共表达分析，从柑橘和楝科植物中筛选候选基因，利用农杆菌介导在本氏烟草中异源表达重构柠檬苦素生物合成通路，并结合LC-MS和NMR鉴定中间体结构，系统解析了植物三萜复杂骨架重构的酶促机制。研究组装了楝树约230 Mbp的基因组，重构了部分通路并纯化鉴定多个关键中间体，包括apo-melianol（13.1 mg）和epi-neemfruitin B（2.25 mg）等。研究发现C-7位O-乙酰化是C-4断裂的关键前提，MaCYP716AD4/CsCYP716AD2在缺乏该修饰时生成副产物（约0.6 mg），而CsL7AT/MaL7AT对呋喃环形成和C-4断裂至关重要。此外，研究鉴定了参与C环氧化开环（Baeyer-Villiger型反应）和甲基迁移的新型酶。这些发现揭示了柠檬苦素骨架重构的关键酶促步骤，构建了从简单三萜到柠檬苦素骨架的部分通路，为理解植物三萜结构多样性的分子机制提供了新见解。

创新点

鉴定了参与C环氧化开环（Baeyer-Villiger型反应）、甲基迁移和呋喃环形成等复杂骨架重构的新型酶，并证明C-7 O-乙酰化是C-4断裂的关键前提。

研究对象（27）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsOSC1 氧化鲨烯环化酶 催化 催化2,3-氧化鲨烯环化生成香树素骨架
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsCYP71CD1 细胞色素P450单加氧酶 催化 催化香树素的C-24氧化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsCYP71BQ4 细胞色素P450单加氧酶 催化 催化C-7位氧化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsCYP88A51 细胞色素P450单加氧酶 催化 催化melianol的C-21甲基羟基化并形成环氧化物前体
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsMOI1 甾醇异构酶类蛋白 催化 催化melianol环氧化物重排生成apo-melianol
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsMOI2 甾醇异构酶类蛋白 催化 与CsCYP88A51协同催化形成apo-melianol（C-21差向异构体混合物）
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsL21AT 乙酰转移酶 催化 催化apo-melianol的C-21羟基乙酰化生成21-acetoxyl-apo-melianol
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsSDR 短链脱氢酶/还原酶 催化 催化C-3位酮基还原/氧化修饰，生成21(S)-acetoxyl-apo-melianone
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsCYP716AC1 细胞色素P450单加氧酶 催化 催化C-4位去甲基化或C-1位氧化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsCYP88A37 细胞色素P450单加氧酶 催化 与CsCYP716AC1协同氧化，参与C-4断裂
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsL1AT 乙酰转移酶 催化 催化C-1羟基乙酰化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsL7AT 乙酰转移酶 催化 催化C-7 O-乙酰化，对呋喃环形成和C-4断裂至关重要
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsAKR 醛酮还原酶 催化 催化C-3位立体选择性还原或C-4侧链修饰
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsCYP716AD2 细胞色素P450单加氧酶 催化 催化Baeyer-Villiger型氧化开环，需要C-7 O-乙酰化底物
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 CsLFS 柠檬苦素呋喃合酶 催化 催化呋喃环的形成
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaCYP71CD2 细胞色素P450单加氧酶 催化 与CsCYP71CD1同源，催化C-24氧化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaCYP71BQ5 细胞色素P450单加氧酶 催化 与CsCYP71BQ4同源，催化C-7氧化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaCYP88A108 细胞色素P450单加氧酶 催化 催化melianol环氧化，与MaMOI2共同生成apo-melianol
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaMOI2 甾醇异构酶类蛋白 催化 与MaCYP88A108协同催化环氧化物重排生成apo-melianol
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaL21AT 乙酰转移酶 催化 催化apo-melianol的C-21乙酰化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaSDR 短链脱氢酶/还原酶 催化 催化C-3位氧化还原修饰
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaCYP88A164 细胞色素P450单加氧酶 催化 参与C-4去甲基化或后续氧化步骤
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaL1AT 乙酰转移酶 催化 催化C-1羟基乙酰化
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaL7AT 乙酰转移酶 催化 催化C-7 O-乙酰化，对呋喃环形成和C-4断裂至关重要
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaAKR 醛酮还原酶 催化 催化C-3位立体选择性还原，基因组预测截短，经转录组组装获得全长序列
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaCYP716AD4 细胞色素P450单加氧酶 催化 催化Baeyer-Villiger型氧化开环，需要C-7 O-乙酰化底物，否则产生副产物(20)
Nicotiana benthamiana 柠檬苦素生物合成通路 MaLFS 柠檬苦素呋喃合酶 催化 催化呋喃环的形成

关键发现

  1. 组装了M. azedarach基因组（约230 Mbp，14条伪染色体）
  2. 通过异源表达在N. benthamiana中重构了部分柠檬苦素生物合成通路，纯化并NMR鉴定了中间体apo-melianol (13.1 mg)、21(S)-acetoxyl-apo-melianone (77.25 mg)、epi-neemfruitin B (2.25 mg)、compund 14 (约20 mg)、azadirone (约1 mg)等
  3. 发现MaCYP716AD4/CsCYP716AD2需要C-7 O-乙酰化底物，否则生成副产物(20)（约0.6 mg）
  4. CsL7AT/MaL7AT对呋喃环形成和C-4断裂至关重要
  5. RNA-seq共获得超过635 million paired end reads。

研究结论

本研究揭示了柠檬苦素生物合成中复杂骨架重构的关键酶促步骤，构建了从简单三萜到柠檬苦素骨架的部分通路，为植物三萜多样性形成的分子机制提供了新见解。