New Insight into the Cleavage Reaction of Nostoc sp. Strain PCC 7120 Carotenoid Cleavage Dioxygenase in Natural and Nonnatural Carotenoids
- 作者
- Jinsol Heo, Se Hyeuk Kim, Pyung Cheon Lee
- 单位
- Department of Molecular Science and Technology and Department of Applied Chemistry and Biological Engineering, Ajou University, Woncheon-Dong, Yeongtong-gu, Suwon, South Korea
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2013）
- DOI
- 10.1128/AEM.00071-13
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Nostoc sp. PCC 7120的类胡萝卜素裂解双加氧酶NSC3的切割活性与底物偏好，尤其是对天然和非天然类胡萝卜素结构的切割。
研究策略
利用合成生物学方法在大肠杆菌中构建表达多种C30和C40类胡萝卜素的合成模块，结合体内外酶活测定、HPLC和LC-MS表征NSC3的切割位点及产物。
研究路线图
核心内容
本研究以蓝藻Nostoc sp. PCC 7120的类胡萝卜素裂解双加氧酶NSC3为对象，在大肠杆菌中构建了多种C30和C40类胡萝卜素合成模块，结合体内外酶活测定与HPLC-LC-MS分析，系统考察了NSC3对天然及非天然底物的切割特异性。结果显示，NSC3对β-apo-8'-胡萝卜素醛具有三个切割位点（C-13-C-14、C-15-C-15'、C-13'-C-14'），体外生成trans-retinal（C20）、cis/trans-β-apo-14'-胡萝卜素醛（C22）和β-apo-13-胡萝卜酮（C18），动力学参数为Km=27.8±3.4 μM，kcat/Km=1.85±0.04 μM⁻¹s⁻¹。该酶还能切割多种非天然C30类胡萝卜素，如4,4'-diaponeurosporene生成C17 apo-14'-diaponeurosporenal，4,4'-diapotorulen-4'-al生成C22和C17产物，并能将torulene转化为retinal。然而它无法作用于lycopene、β-carotene等非全共轭双键的C40底物。上述结果表明NSC3偏好全共轭双键结构的类胡萝卜素，具备广谱切割活性，可用于生产新型脱辅基类胡萝卜素，在生物技术应用中具有潜在价值。
创新点
首次发现NSC3对β-apo-8'-胡萝卜素醛具有三个切割位点（C-13-C-14、C-15-C-15'、C-13'-C-14'）；证明NSC3能利用天然和非天然的C30类胡萝卜素（如4,4'-diaponeurosporene等）产生新型脱辅基类胡萝卜素。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | all4895 | NSC3 (carotenoid cleavage dioxygenase) | 催化 | 目标酶，切割类胡萝卜素 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtM, crtN | — | 催化 | 来自金黄色葡萄球菌的C30类胡萝卜素合成模块，产生4,4'-diaponeurosporene |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtP | — | 催化 | 编码4,4-diaponeurosporene oxidase，产生醛基类胡萝卜素 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | crtYcYd | — | 催化 | 来自Brevibacterium linens，用于产生环化C30类胡萝卜素 |
| Escherichia coli | C30类胡萝卜素生物合成 | aldH | — | 催化 | 编码醛脱氢酶，产生羧基类胡萝卜素 |
| Escherichia coli | C40类胡萝卜素生物合成 | crtE, crtB, crtI | — | 催化 | 产生番茄红素或3,4,3',4'-tetradehydrolycopene |
| Escherichia coli | C40类胡萝卜素生物合成 | crtY, crtZ | — | 催化 | 产生β-胡萝卜素和玉米黄质 |
关键发现
NSC3在体外切割β-apo-8'-胡萝卜素醛产生trans-retinal (C20, [M+H]+=285.2)、cis/trans-β-apo-14'-胡萝卜素醛 (C22, [M+H]+=311.4)和β-apo-13-胡萝卜酮 (C18, [M+H]+=259.1)。动力学参数：Km=27.8±3.4 μM，Vmax=0.29±0.03 μM/min，kcat=51.54±5.41 s^-1，kcat/Km=1.85±0.04 μM^-1 s^-1。在体内外，NSC3切割4,4'-diaponeurosporene生成C17 apo-14'-diaponeurosporenal ([M+H]+=244.18)，切割4,4'-diaponeurosporen-4'-al生成C22 apo-10'-diaponeurosporenal ([M+H]+=310.23)和C17 apo-14'-diaponeurosporenal，切割4,4'-diaponeurosporen-4'-oic acid生成C22 apo-10'-diaponeurosporenal，切割4,4'-diapotorulene生成C17 apo-14'-diapotorulenal ([M+H]+=244.16)，切割4,4'-diapotorulen-4'-al生成C22 apo-10'-diapotorulenal ([M+H]+=310.25)，切割torulene生成retinal ([M+H]+=284.21)。NSC3不能切割lycopene、β-carotene和zeaxanthin等非全共轭双键的C40类胡萝卜素。
研究结论
NSC3具有独特的广谱切割活性，偏好具有全共轭双键的类胡萝卜素，能利用天然和非天然C30类胡萝卜素产生新型脱辅基类胡萝卜素，这些产物具有潜在的生物技术应用价值。