Identification and Characterization of a Novel Terrabacter ginsenosidimutans sp. nov. β-Glucosidase That Transforms Ginsenoside Rb1 into the Rare Gypenosides XVII and LXXV
- 作者
- Dong-Shan An, Chang-Hao Cui, Hyung-Gwan Lee, Liang Wang, Sun Chang Kim, Sung-Taik Lee, Fengxie Jin, Hongshan Yu, Young-Won Chin, Hyeong-Kyu Lee, Wan-Taek Im, Song-Gun Kim
- 单位
- Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Daejeon 305-806, Republic of Korea; Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon 305-701, Republic of Korea; College of Bio & Food Technology, Dalian Polytechnic University, Qinggong-yuan No. 1, Ganjingzi-qu, Dalian 116034, People's Republic of China; Immune Modulator Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Ochang-eup, Cheongwon-gun, ChungBuk 363-883, Republic of Korea
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1128/AEM.00106-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
人参皂苷Rb1等主要皂苷因分子大、溶解度低而难以被人体直接吸收，需要转化为稀有皂苷以提高药理活性；现有物理化学方法不特异，酶法特异但缺乏能高效产生特定稀有皂苷（如Gyp XVII和LXXV）的克隆酶。
研究策略
从人参田土壤中分离具有β-葡萄糖苷酶活性的新菌株Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil 3082，构建基因组fosmid文库，通过蓝色筛选和TLC筛选获得阳性克隆，测序后克隆bgpA基因并在E. coli中表达，纯化重组酶，通过动力学、底物特异性和转化产物分析表征其功能。
研究路线图
核心内容
本研究从人参田土壤中分离出一株新型菌株Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil 3082，通过构建基因组fosmid文库并结合蓝色筛选与薄层色谱筛选，克隆到一个编码糖苷水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因bgpA（1,947 bp），并在大肠杆菌中异源表达、纯化获得重组酶BgpA。酶学表征显示，该酶对人工底物pNPGlc的Km为4.2 mM，对人参皂苷Rb1的Km为0.14 mM，催化效率高；最适pH为7.0、最适温度为45°C。BgpA以三聚体形式存在，并通过顺序水解Rb1的C-3位外糖、C-3位内糖及C-20位外糖，将Rb1依次转化为稀有人参皂苷Gyp XVII、Gyp LXXV，最终生成C-K。在0.1 mg/ml酶浓度下，1 mg/ml Rb1可在5分钟内完全转化，产物经NMR和MS确认。该工作首次报道了能够以独特顺序选择性生成Gyp XVII和LXXV的克隆酶，为稀有皂苷的酶法高效制备提供了新的工具酶和清晰的生物转化路径。
创新点
首次克隆并表征了糖苷水解酶家族3的人参皂苷转化β-葡萄糖苷酶BgpA；该酶以独特的顺序选择性水解Rb1的C-3位外糖、C-3位内糖和C-20位外糖，从而生成稀有人参皂苷Gyp XVII和LXXV。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C41(DE3) | 人参皂苷Rb1→Gyp XVII→Gyp LXXV→C-K | bgpA | BgpA β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 重组酶表达与纯化 |
| Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil 3082 | — | — | — | — | bgpA基因来源菌株，新物种 |
关键发现
- 首次从新种Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil 3082中克隆了bgpA基因（1,947 bp），编码家族3 β-葡萄糖苷酶BgpA。重组酶对pNPGlc的Km为4.2±0.8 mM，Vmax为100.6±17.1 μmol·min⁻¹·mg⁻¹
- 对人参皂苷Rb1的Km为0.14±0.05 mM，Vmax为329±31 μmol·min⁻¹·mg⁻¹。最佳pH为7.0，最佳温度为45°C
- 45°C孵育30 min损失32%活性。纯化倍数为20.8倍，回收率13%。酶以三聚体形式存在（分子量193 kDa，单体70 kDa）。BgpA顺序水解Rb1的C-3位外糖、C-3位内糖和C-20位外糖，转化途径为Rb1→Gyp XVII→Gyp LXXV→C-K。在0.1 mg/ml酶浓度下，1 mg/ml Rb1在5 min内完全水解。产物经NMR和MS确认。
研究结论
成功克隆并表征了一种新的家族3 β-葡萄糖苷酶BgpA，它能特异性地将人参皂苷Rb1顺序转化为稀有皂苷Gyp XVII、Gyp LXXV和C-K，为稀有皂苷的酶法生产提供了新的工具酶和生物转化途径。