Redesign, Reconstruction, and Directed Extension of the Brevibacterium linens \(C_{40}\) Carotenoid Pathway in Escherichia coli
- 作者
- Se Hyeuk Kim, Yun Hee Park, Claudia Schmidt-Dannert, Pyung Cheon Lee
- 单位
- Department of Molecular Science and Technology and Department of Biotechnology, Ajou University; Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1128/AEM.00263-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在异源宿主大肠杆菌中重构、重设计并延伸Brevibacterium linens的C40类胡萝卜素生物合成途径，以产生结构多样且自然界难以获得的类胡萝卜素化合物。
研究策略
采用组合生物合成策略，将B. linens的番茄红素、β-胡萝卜素等模块化途径在大肠杆菌中功能组装，并引入来自其他物种的混杂性修饰酶（如突变体CrtY2、CrtA、CrtZ、CrtU）进行途径延伸，利用酶的底物混杂性产生新型类胡萝卜素。
核心内容
本研究在大肠杆菌中系统重构了Brevibacterium linens的C40类胡萝卜素生物合成途径，并借助组合生物合成策略实现途径延伸以生成结构多样的稀有类胡萝卜素。通过模块化组装番茄红素、β-胡萝卜素等核心途径，并结合来自其他物种的混杂性修饰酶（如突变体CrtY2、CrtA、CrtZ、CrtU）进行功能串联，作者发现B. linens的八氢番茄红素脱氢酶CrtI在异源宿主中意外产生3,4-二脱氢番茄红素，与番茄红素比例约为1:5.6；β-胡萝卜素途径则生成7,8-二氢-β-胡萝卜素。进一步延伸3,4-二脱氢番茄红素途径与突变体CrtY2共表达可生成torulene，与CrtA共表达产生1,2-二氢番茄红素-2-酮；而β-胡萝卜素途径与CrtU和CrtZ共表达则获得isorenieratene、zeaxanthin以及不对称的agelaxanthin A。此外，B. linens的细胞色素P450在大肠杆菌中无法羟化β-胡萝卜素。结果表明，异源重构结合酶底物混杂性是产生自然界中难以获得的不对称或新型类胡萝卜素的有效策略。
创新点
['首次在大肠杆菌中系统重构了B. linens的类胡萝卜素合成途径', '发现B. linens的八氢番茄红素脱氢酶CrtI在异源宿主中意外产生3,4-二脱氢番茄红素', '通过途径延伸获得了torulene、agelaxanthin A等稀有不对称类胡萝卜素']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Brevibacterium linens DSMZ 20426，催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合成 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Brevibacterium linens DSMZ 20426，催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Brevibacterium linens DSMZ 20426，在E. coli中除产生番茄红素外还意外产生3,4-二脱氢番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtYcYd | 番茄红素环化酶（异二聚体） | 催化 | 来自Brevibacterium linens，由CrtYc和CrtYd两个亚基组成，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtU | β-胡萝卜素脱氢酶 | 催化 | 来自Brevibacterium linens，催化β-胡萝卜素脱氢及甲基转移生成芳香族类胡萝卜素isorenieratene |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | ORF10 | 细胞色素P450单加氧酶 | 催化 | 来自Brevibacterium linens DSMZ 20426，在E. coli中未能羟化β-胡萝卜素，推测因缺乏辅因子 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtA | 球烯单加氧酶 | 催化 | 来自Rhodobacter capsulatus DSMZ 1710，催化无环类胡萝卜素的酮基化，产生1,2-二氢番茄红素-2-酮等 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis DSMZ 30080，催化β-胡萝卜素羟基化生成zeaxanthin |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtY2 | 突变型番茄红素环化酶 | 催化 | 来自Pantoea的体外进化突变体，可催化3,4-二脱氢番茄红素环化生成torulene |
关键发现
- 重构的番茄红素途径产生意外的3,4-二脱氢番茄红素（m/z
- 69），与番茄红素的比例为1:5.6；β-胡萝卜素途径意外产生7,8-二氢-β-胡萝卜素（m/z 539）；延伸3,4-二脱氢番茄红素途径与突变体CrtY2共表达生成torulene（m/z
- 86）和β-胡萝卜素；与CrtA共表达生成1,2-二氢番茄红素-2-酮（m/z
- 74）；β-胡萝卜素途径与CrtU和CrtZ共表达生成isorenieratene（m/z
- 91）、zeaxanthin（m/z
- 8）以及不对称的agelaxanthin A（m/z
- 77）；B. linens细胞色素P450无法在E. coli中羟化β-胡萝卜素。
研究结论
在异源宿主中重构生物合成途径并利用混杂性酶进行延伸，是产生结构多样化类胡萝卜素的有效策略，可生成自然界中难以获得的不对称或新型化合物。