Gene Overexpression and RNA Silencing Tools for the Genetic Manipulation of the (S)-(-)-Abscisic Acid Producing Ascomycete Botrytis cinerea
- 作者
- Zhong-Tao Ding, Zhi Zhang, Di Luo, Jin-Yan Zhou, Juan Zhong, Jie Yang, Liang Xiao, Dan Shu, Hong Tan
- 单位
- Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology, Chengdu Institute of Biology, the Chinese Academy of Sciences; University of the Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- International Journal of Molecular Sciences（2015）
- DOI
- 10.3390/ijms160510301
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
为产脱落酸（ABA）的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）开发高效、便捷的基因过表达和RNA沉默遗传操作工具，以调控其次级代谢物生物合成基因的表达水平。
研究策略
基于农杆菌介导转化（ATMT），利用In-Fusion组装方法构建两个带不同筛选标记的过表达载体（pCBh1、pCBg1）和一个RNA沉默载体（pCBSilent1），并通过eGFP及内源ABA生物合成基因bcaba4的过表达和沉默验证其效率。
核心内容
该研究针对产脱落酸（ABA）的灰葡萄孢开发了一套基于农杆菌介导转化（ATMT）的基因过表达和RNA沉默操作工具。作者利用In-Fusion组装构建了两个携带不同筛选标记（潮霉素或草铵膦）的过表达载体pCBh1和pCBg1，以及一个以稻瘟病菌角质酶基因内含子2为间隔区的RNA沉默载体pCBSilent1，并采用构巢曲霉强组成型oliC启动子驱动基因表达。ATMT转化效率为1×10⁶个分生孢子可获得500–1000个转化子。通过eGFP报告基因和脱落酸生物合成关键基因bcaba4的验证，过表达bcaba4使ABA产量达到6.0 mg/L培养基，是亲本菌株的30倍；RNA沉默实验中，45个转化子中有21个的ABA相对产量降至亲本的20%以下。这些结果首次证实bcaba4确实参与灰葡萄孢ABA生物合成，且所建立的双载体体系可高效实现基因过表达和沉默，为构建高产ABA工程菌株及其他丝状真菌的遗传操作提供了实用工具。
创新点
首次在灰葡萄孢ATMT中采用强组成型启动子（构巢曲霉oliC启动子）驱动外源或内源基因表达；开发了带不同筛选标记（潮霉素/草铵膦）的双表达载体及以稻瘟病菌角质酶基因内含子2为间隔区的RNA沉默载体；首次实现bcaba4基因过表达促进ABA积累，并首次用RNA沉默载体操作灰葡萄孢次级代谢物生物合成基因。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Botrytis cinerea Bc-6 | 脱落酸（ABA）生物合成 | bcaba4 | 短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenase/reductase） | 催化 | 过表达该基因使ABA产量达6.0 mg/L，为亲本的30倍；沉默该基因使ABA产量显著降低 |
| Botrytis cinerea Bc-6-eGFP | 报告基因表达 | eGFP | 增强绿色荧光蛋白 | 调控 | 用于验证RNA沉默效率，45个转化子中20个几乎无荧光，mRNA水平降至20%以下 |
| Botrytis cinerea Bc-6-A4 | 脱落酸（ABA）生物合成 | bcaba4 | 短链脱氢酶/还原酶（short-chain dehydrogenase/reductase） | 催化 | ABA产生菌株，用于bcaba4基因沉默，45个转化子中21个ABA相对产量低于亲本20% |
关键发现
- ATMT转化1×10^6个分生孢子可获得500-1000个转化子
- 25 μg/mL潮霉素B或草铵膦可完全抑制灰葡萄孢Bc-6生长
- pCBh1和pCBg1均高效表达eGFP
- bcaba4过表达使ABA产量达6.0 mg/L培养基，为亲本Bc-6的30倍
- pCBSilent1-eGFP沉默转化子中45个随机转化子全部表现不同程度荧光减弱，其中20个几乎检测不到GFP荧光，6个检测的转化子中3个eGFP mRNA水平降至亲本的20%以下
- pCBSilent1-ABA4沉默后，45个转化子中21个ABA相对产量低于亲本的20%（小于20%），6个检测转化子中3个bcaba4 mRNA水平降至亲本的20%以下。
研究结论
成功开发了适用于灰葡萄孢ATMT的三个双元载体（pCBh1、pCBg1、pCBSilent1），具有高效过表达和沉默基因的能力；通过过表达和RNA沉默实验证实bcaba4参与ABA生物合成，且过表达bcaba4可显著促进ABA产量，这些工具可用于构建基因工程改造的高产ABA灰葡萄孢菌株，并可能推广至其他丝状真菌。