Gene amplification on demand accelerates cellobiose utilization in engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Eun Joong Oh, Jeffrey M. Skerker, Soo Rin Kim, Na Wei, Timothy L. Turner, Matthew J. Maurer, Adam P. Arkin, Yong-Su Jin
- 单位
- Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Bioengineering, University of California at Berkeley; Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University; Department of Civil and Environmental Engineering and Earth Sciences, University of Notre Dame
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.00410-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工程化酿酒酵母利用纤维二糖的效率低，且葡萄糖抑制阻碍混合糖共发酵；基于游离质粒的表达系统不稳定，导致纤维二糖发酵速率低、产物积累副产物。
研究策略
将来源于粗糙脉孢菌的纤维二糖转运蛋白基因(cdt-1)和胞内β-葡萄糖苷酶基因(gh1-1)整合到酿酒酵母基因组中，通过以纤维二糖为唯一碳源的连续传代进行实验室进化，筛选快速利用纤维二糖的突变株，并通过基因组测序和qPCR分析基因拷贝数变化。
研究路线图
核心内容
针对工程酿酒酵母纤维二糖利用效率低且游离质粒表达不稳定的问题，该研究提出并验证了“按需基因扩增”策略。作者将粗糙脉孢菌的纤维二糖转运蛋白基因cdt-1和胞内β-葡萄糖苷酶基因gh1-1整合至酵母基因组，并以纤维二糖为唯一碳源进行连续传代进化。初始菌株EJ1的纤维二糖消耗速率仅0.18 g/L·h，经实验室进化获得的菌株EJ2将发酵速率提升15倍至2.73 g/L·h，乙醇产率由0.18 g/g升至0.40 g/g，体积生产速率从0.037 g/L·h跃升至1.09 g/L·h。基因组测序与qPCR证实，选择压力下整合基因发生自发串联扩增，EJ2中cdt-1与gh1-1拷贝数分别达9和23，且二者比例接近1:2。在CEN.PK2-1D菌株中增加两基因拷贝数同样能提升发酵性能。EJ2在无选择压力下连续传代后，基因拷贝数虽略有下降，但纤维二糖消耗速率和乙醇产率几乎保持不变，表明高拷贝扩增表型稳定。该工作证明纤维二糖转运与水解是工程酵母发酵的限速步骤，按需基因扩增无需抗生素或诱导剂即可实现稳定的基因剂量优化，为酵母代谢工程提供了一种工业适用的策略。
创新点
首次展示了"按需基因扩增"策略：在纤维二糖选择压力下，整合的异源基因自发串联扩增，显著提高发酵速率；发现cdt-1与gh1-1拷贝数最佳比例约为1:2；无需抗生素或诱导剂，仅以纤维二糖作为选择压力即可获得稳定高拷贝整合菌株。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖同化 | cdt-1 | CDT-1 | 转运 | 来自Neurospora crassa的细胞糊精转运蛋白，负责将纤维二糖转运入胞内 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 纤维二糖同化 | gh1-1 | GH1-1 | 催化 | 来自Neurospora crassa的胞内β-葡萄糖苷酶，将纤维二糖水解为葡萄糖 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 纤维二糖同化 | cdt-1 | CDT-1 | 转运 | 用于验证拷贝数对纤维二糖发酵影响的菌株，携带不同拷贝数的游离质粒 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D | 纤维二糖同化 | gh1-1 | GH1-1 | 催化 | 用于验证拷贝数对纤维二糖发酵影响的菌株，携带不同拷贝数的游离质粒 |
关键发现
- 初始整合菌株EJ1的纤维二糖消耗速率仅0.18 g/L·h，经实验室进化后获得菌株EJ2，其纤维二糖发酵速率提高15倍（至2.73 g/L·h），乙醇产率由0.18 g/g提高到0.40 g/g，乙醇体积生产速率由0.037 g/L·h提高到1.09 g/L·h。EJ2中cdt-1拷贝数为9，gh1-1拷贝数为23，而EJ1中分别为1和2
- PFGE验证染色体扩增。在CEN.PK2-1D菌株中，增加cdt-1或gh1-1质粒拷贝数均能提高纤维二糖消耗速率和乙醇生产速率，其中CEN-C3B1比CEN-C1B1的纤维二糖消耗速率和乙醇生产速率分别提高35%和39%。EJ2在葡萄糖中连续传代后（EJ2-10），cdt-1和gh1-1拷贝数分别降至7和17，但纤维二糖消耗速率(2.62 g/L·h)和乙醇产率(0.40 g/g)基本保持，表明扩增基因稳定性良好。
研究结论
纤维二糖同化途径（转运和水解）是工程酵母纤维二糖发酵的限速步骤；通过实验室进化实现按需基因扩增可大幅提高纤维二糖发酵性能，且所得高拷贝整合菌株在无选择压力下仍能保持稳定表型，该策略可为酵母代谢工程提供一种高效、工业适用的基因剂量优化方法。