Application of AlkBGT and AlkL from Pseudomonas putida GPo1 for Selective Alkyl Ester ω-Oxyfunctionalization in Escherichia coli
- 作者
- Youri M. van Nuland, Gerrit Eggink, Ruud A. Weusthuis
- 单位
- Bioprocess Engineering, Wageningen University, Wageningen, Netherlands; Biobased Products, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, Netherlands
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology
- DOI
- 10.1128/AEM.00822-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
利用AlkBGT酶系统对中链脂肪酸乙酯、丙酯、丁酯进行选择性ω-氧化，以实现ω-羟基脂肪酸酯的可持续生产；同时探究外膜蛋白AlkL对底物转运和催化活性的影响。
研究策略
在Escherichia coli中异源表达来自Pseudomonas putida GPo1的AlkBGT（pBT10）及与AlkL共表达（pBTL10），以全细胞生物转化方式测试C6至C10脂肪酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯的ω-氧化活性；进行毒性实验、初始活性测定、时间进程实验，并比较不同碳链长度下AlkL的增效作用。
研究路线图
核心内容
本研究在Escherichia coli中异源表达了来自Pseudomonas putida GPo1的AlkBGT烷烃羟化酶系统，并构建了与Outer膜蛋白AlkL共表达的菌株，系统考察了该酶系统对C6至C10脂肪酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯的ω-氧化活性。结果显示，AlkBGT首次被证实能够高效ω-氧化乙基、丙基和丁基脂肪酸酯，其中对己酸丁酯的活性最高达82 U/gcdw，接近对甲基壬酸酯的活性水平。共表达AlkL使乙基壬酸酯的ω-氧化初始活性提高1.7倍至70 U/gcdw，但AlkL的促进作用仅出现在总碳数≥11的疏水性底物上，表明其转运增强效应与底物膜通透性（log P值）密切相关。在5 mM底物转化中，pBTL10菌株120分钟内可将90%的甲基壬酸酯转化为ω-氧化产物，其中9-羟基NAEE浓度达3.6 mM。此外，酯化底物有效规避了游离脂肪酸的细胞毒性，E. coli在10 mM乙基壬酸酯下仍能正常生长，而在10 mM壬酸中生长完全停止。这些结果证明AlkBGT(L)系统可作为可持续生产ω-羟基脂肪酸酯（聚合物重要前体）的高效温和生物催化剂，且酯基链延长策略为提升短链脂肪酸酯氧化活性提供了新思路。
创新点
['首次证明AlkBGT系统能够ω-氧化乙基、丙基和丁基脂肪酸酯，扩展了底物范围。', '发现AlkL仅对总碳数≥11的酯底物有显著促进作用，并关联log P值解释底物膜通透性。', '利用酯化底物避免了游离脂肪酸对细胞的毒性，并简化产物回收过程。', '揭示了短链脂肪酸酯（C6-C7）可通过延长酯基链提升ω-氧化活性。']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli NEBT7 | 烷烃羟化系统 | alkB | AlkB | 催化 | 膜结合烷烃单加氧酶，催化酯底物末端甲基的ω-羟基化 |
| Escherichia coli NEBT7 | 烷烃羟化系统 | alkG | AlkG | 能量供给 | rubredoxin，作为电子转移载体将电子从AlkT传递给AlkB |
| Escherichia coli NEBT7 | 烷烃羟化系统 | alkT | AlkT | 能量供给 | rubredoxin还原酶，利用NADH还原AlkG，为氧化反应提供还原力 |
| Escherichia coli NEBT7 | 烷烃羟化系统 | alkL | AlkL | 转运 | 外膜蛋白，促进疏水性酯底物跨膜摄取，提高生物可得性 |
| Escherichia coli TOP10 | — | — | — | — | 用于质粒克隆的宿主菌 |
关键发现
- ['共表达AlkL使乙基壬酸酯（NAEE）的ω-氧化活性比单独表达AlkBGT提高1.7倍，初始活性达70 U/gcdw，为甲基壬酸酯（NAME）活性的67%。', '时间进程实验中，5mM NAEE经pBTL10菌株120min转化，主要产物9-羟基NAEE浓度达3.6mM，同时生成9-氧代NAEE
- 1mM和9-羧基NAEE
- 6mM。', 'AlkBGT对己酸丁酯的ω-氧化活性最高，达82 U/gcdw，接近对NAME的活性（84-105 U/gcdw）。', 'AlkL仅在底物总碳数≥11时提高初始活性（如乙基壬酸酯、丙基辛酸酯等），但对甲基壬酸酯无显著改善（1.3倍）。', '在5mM NAME转化中，pBTL10菌株120min内转化4.4mM（约90%）为ω-氧化产物，主要产物为9-羟基NAME，醇/酸比为100:17。', 'E. coli在10mM NAEE下仍能生长（μ=0.30 h-1），而在10mM壬酸下生长停止（μ=-0.24 h-1），表明酯化底物毒性显著更低。']
研究结论
AlkBGT(L)可作为中链脂肪酸乙酯、丙酯和丁酯ω-氧化的高效生物催化剂，能够以温和条件将可再生脂肪酸酯转化为聚合物前体ω-羟基脂肪酸酯；AlkL对疏水性更强的长链底物（总碳数≥11）具有显著的转运增强作用。