Mutational and Functional Analysis of the β-Carotene Ketolase Involved in the Production of Canthaxanthin and Astaxanthin

作者: Rick W. Ye, Kristen J. Stead, Henry Yao, Hongxian He
单位: DuPont Central Research and Development, Wilmington, Delaware
杂志: Applied and Environmental Microbiology（2006）
DOI: 10.1128/AEM.00918-06
所属领域: 代谢工程
关键词: CrtWβ-胡萝卜素酮醇酶丙氨酸扫描突变定向进化虾青素角黄素
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解决的核心问题

解析β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)中保守氨基酸残基的功能作用，并提高CrtW在虾青素生物合成中的催化效率与选择性。

研究策略

采用丙氨酸扫描突变系统分析CrtW保守残基的功能，利用颜色筛选系统结合易错PCR随机突变，筛选具有更高虾青素选择性的CrtW突变体。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究以大肠杆菌为宿主，系统解析了β-胡萝卜素酮醇酶（CrtW）保守氨基酸残基的功能，并借助基于菌落颜色的高通量筛选系统，通过易错PCR随机突变筛选出提高虾青素选择性的CrtW突变体。丙氨酸扫描发现H65、H103、H106、H107、H221和H222为催化必需残基，D117A突变在含β-胡萝卜素基因簇的宿主中导致echinone大量积累至62.1%，而野生型仅为2.5%，说明D117对底物特异性具有关键影响。随机突变获得的L175M突变体在含玉米黄质合成基因簇的菌株中使虾青素比例从野生型的53%提升至78%，adonixanthin从33%降至5%；M99V和M99I同样显著提高虾青素产量。含玉米黄质与β-胡萝卜素基因簇的菌株总类胡萝卜素滴度分别达0.6 mg/g和0.9 mg/g干细胞重。该研究不仅阐明了CrtW的催化机制与底物选择性决定位点，还提供了可直接用于代谢工程改造的有效突变位点，为虾青素的高效微生物合成奠定了基础。

创新点

开发了基于菌落颜色的高通量筛选系统，用于识别提高虾青素选择性的CrtW突变体；首次报道L175M、M99V和M99I三个突变能显著提高虾青素产量；发现部分失活突变导致单酮基中间体积累，如D117A导致echinone大量积累。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli Top 10	类胡萝卜素生物合成（虾青素/角黄素）	crtW	β-胡萝卜素酮醇酶(CrtW)	催化	来自Paracoccus sp. N81106，丙氨酸扫描和随机突变的研究对象
Escherichia coli Top 10	类胡萝卜素生物合成（玉米黄质）	crtZ	β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)	催化	与crtW共表达，用于合成含羟基的类胡萝卜素中间体
Escherichia coli Top 10	β-胡萝卜素生物合成	crtE, idi, crtY, crtI, crtB	GGPP合酶、异戊烯基焦磷酸异构酶、番茄红素β-环化酶、八氢番茄红素脱氢酶、八氢番茄红素合酶	催化	基因簇crtE-idi-crtYIB，用于合成β-胡萝卜素前体
Escherichia coli MG1655 P_TS-dxs	类胡萝卜素生物合成（虾青素）	crtW	CrtW酮醇酶（突变体L175M、M99V、M99I）	催化	高碳通量菌株中评估突变体对虾青素产量的改善效果

关键发现

野生型CrtW在含玉米黄质合成基因簇的E. coli中产生72.0%虾青素、16.1%adonixanthin、1.6%玉米黄质
在含β-胡萝卜素合成基因簇的宿主中产生91.3%角黄素。丙氨酸扫描显示H65、H103、H106、H107、H221、H222为酶活性必需，H69和H218部分必需。D117A突变在β-胡萝卜素宿主中积累62.1%的echinone，而野生型仅2.5%。随机突变体L175M在高通量菌株中使虾青素比例从野生型的53%提高到78%，adonixanthin从33%降至5%。含玉米黄质基因簇和β-胡萝卜素基因簇的菌株总类胡萝卜素滴度分别为0.6 mg/g和0.9 mg/g干细胞重。

研究结论

CrtW属于铁依赖的整合膜蛋白家族，三个组氨酸基序是催化所必需的，但并非所有保守组氨酸都同样重要。D117等残基对底物特异性有重要影响。通过颜色筛选系统获得的L175M、M99V和M99I突变体提高了虾青素选择性，可用于代谢工程改造虾青素生物合成途径。