Identification and Characterization of a Mucilaginibacter sp. Strain QM49 β-Glucosidase and Its Use in the Production of the Pharmaceutically Active Minor Ginsenosides (S)-Rh1 and (S)-Rg2
- 作者
- Chang-Hao Cui, Qing-Mei Liu, Jin-Kwang Kim, Bong-Hyun Sung, Song-Gun Kim, Sun-Chang Kim, Wan-Taek Im
- 单位
- Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon, Republic of Korea; KAIST Institute for Biocntury, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon, Republic of Korea; Intelligent Synthetic Biology Center, Daejeon, Republic of Korea; Systems and Synthetic Biology Research Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Daejeon, Republic of Korea; Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology, Daejeon, Republic of Korea
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2013）
- DOI
- 10.1128/AEM.01150-13
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
稀有皂苷 (S)-Rh1 和 (S)-Rg2 在天然人参中含量极低（低于干重的0.034%），现有物理化学方法产率低、产物为立体异构混合物且难分离，缺乏高效、可规模化的生物转化方法，制约其药理研究和商业化应用。
研究策略
从土壤中筛选具有人参皂苷转化活性的菌株 Mucilaginibacter sp. QM49，构建基因组 fosmid 文库克隆 β-葡萄糖苷酶基因 bglQM，在大肠杆菌中通过 MBP 融合载体表达重组酶，系统表征酶学性质，并优化底物浓度和反应条件，实现 PPT 型皂苷混合物到 (S)-Rh1 和 (S)-Rg2 的克级规模生物转化。
核心内容
研究人员从土壤中分离到一株具有人参皂苷转化活性的菌株Mucilaginibacter sp. QM49，通过构建基因组fosmid文库克隆了一个新的糖苷水解酶家族3 β-葡萄糖苷酶基因bglQM，并在大肠杆菌中以MBP融合形式实现重组表达。该酶能够高选择性地水解人参皂苷Re和Rg1的C-20位葡萄糖，分别生成药理活性稀有皂苷(S)-Rg2和(S)-Rh1。酶学表征显示，重组BglQM对底物Re和Rg1的Km分别为3.22 mM和1.48 mM，最适反应条件为pH 8.0和30°C。在工艺优化中，以20 mg/ml的粗制PPT型人参皂苷混合物为底物，在10 L反应器中反应50小时后Re和Rg1完全转化，经纯化获得5.4 g (S)-Rg2（纯度98%）和4.6 g (S)-Rh1（纯度97%），首次实现了这两种稀有皂苷的克级规模生物制备。该工作为高纯度立体特异性稀有皂苷的工业化生产提供了可行路线，有助于推动其药理研究和应用开发。
创新点
首次报道来源于糖苷水解酶家族3的新型 β-葡萄糖苷酶 BglQM，能够高选择性地水解 Re 和 Rg1 的 C-20 位葡萄糖生成 (S)-Rg2 和 (S)-Rh1；首次利用重组酶以粗制 PPTGM 为底物实现克级规模（5.4 g 和 4.6 g）高纯度 (S)-Rg2 和 (S)-Rh1 的生产。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 人参皂苷生物转化途径 | bglQM | BglQM | 催化 | 来源于 Mucilaginibacter sp. QM49 的 β-葡萄糖苷酶，属于糖苷水解酶家族3，可水解 Re 和 Rg1 的 C-20 位葡萄糖，生成 (S)-Rg2 和 (S)-Rh1；同时可转化 PPD 型皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rd。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 人参皂苷生物转化途径 | bglQM1 | BglQM1 | 催化 | 来自同一菌株的另一个 β-葡萄糖苷酶候选基因，但重组表达后对 Re 和 Rg1 无转化活性，被排除。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 人参皂苷生物转化途径 | malE (MBP) | 麦芽糖结合蛋白 (MBP) | 调控 | 作为融合标签，通过 pMAL-c2x 载体提高重组 BglQM 的可溶性表达，融合蛋白活性与去标签酶一致。 |
关键发现
- bglQM 全长 2346 bp，编码 781 个氨基酸残基，预测分子量
- 6 kDa，属于糖苷水解酶家族3；重组 BglQM 在 pH
- 0 和 30°C 条件下可高效转化 Re 和 Rg1 生成 (S)-Rg2 和 (S)-Rh1；对 pNPGlc、Re、Rg1 的 Km 分别为
- 0±0.4 μM、3.22±0.15 mM、1.48±0.09 mM，Vmax 分别为
- 4±0.6 μmol min⁻¹ mg⁻¹、19.2±0.2 nmol min⁻¹ mg⁻¹、28.8±0.27 nmol min⁻¹ mg⁻¹；对 PNPGlc、Re、Rg1 的 kcat/Km 分别为
- 23±0.13 μM⁻¹ s⁻¹、0.51±0.07 mM⁻¹ min⁻¹、1.64±0.22 mM⁻¹ min⁻¹；利用 60 g PPTGM（含 Re
- 4%、Rg1
- 9%），20 mg/ml 底物浓度，在 10 L 反应器中 pH
- 0、30°C 反应 50 h，Re 和 Rg1 完全转化，经硅胶柱纯化获得
- 4 g (S)-Rg2（纯度 98%±0.5%）和
- 6 g (S)-Rh1（纯度 97%±1.2%）。
研究结论
BglQM 是一种新型、高效的糖苷水解酶家族3 β-葡萄糖苷酶，能够特异性水解人参皂苷 Re 和 Rg1 的 C-20 位葡萄糖，将其转化为具有药理活性的稀有皂苷 (S)-Rg2 和 (S)-Rh1；通过工艺优化，首次实现了以粗制 PPT 型人参皂苷混合物为底物的克级规模生产，为 (S)-Rg2 和 (S)-Rh1 的工业化应用奠定了基础。