高级醇 · 代谢工程文献库

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Acetolactate Synthase from Bacillus subtilis Serves as a 2-Ketoisovalerate Decarboxylase for Isobutanol Biosynthesis in Escherichia coli

作者
Shota Atsumi, Zhen Li, James C. Liao
单位
Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles, California 90095
杂志
Applied and Environmental Microbiology（2009）
DOI
10.1128/AEM.01160-09
所属领域
代谢工程
关键词
2-ketoisovalerate decarboxylaseBacillus subtilisEscherichia coliacetolactate synthaseisobutanol
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解决的核心问题

在大肠杆菌异丁醇生物合成中，2-酮酸脱羧酶（Kdc）通常被认为必不可少，但研究发现不含Kdc的菌株仍能产异丁醇，需要阐明其机制并鉴定替代酶。

研究策略

通过基因敲除和过表达组合确定Kdc非必需；体外纯化并测定野生型及Q487突变体的乙酰乳酸合酶（Als）和2-酮异戊酸脱羧酶（Kdc）活性；结合发酵实验和生长互补实验研究Q487残基的功能。

研究路线图

100%
标题：枯草芽孢杆菌AlsS兼作Kdc促进大肠杆菌异丁醇合成
研究问题：
无Kdc菌株为何仍产异丁醇，
需鉴定替代脱羧酶
策略：
基因敲除/过表达组合分析，
体外活性测定+发酵验证
关键发现①：
仅过表达alsS即可产异丁醇，
kdc与aceE/sucA敲除无影响
关键发现②：
野生型AlsS的Kdc活性
=5.5 μmol·min⁻¹·mg⁻¹
关键改造：
Q487定点突变（Q487A/G/S/L/I/N）
评估对Als/Kdc活性的影响
结果①：
Q487A/G/S保留Als活性但Kdc活性大降，
Q487L/I则相反
结果②：
野生型菌株24h产6.8 g/L，
112h超20 g/L；Q487N产醇正常
结论：
Kdc对异丁醇合成非必需，
AlsS的Q487决定Kdc活性，
可用于途径优化
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核心内容

该研究通过基因敲除、过表达组合、体外酶活测定及定点突变等手段，揭示了大肠杆菌异丁醇生物合成中2-酮酸脱羧酶并非必需，并鉴定出枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶AlsS兼具2-酮异戊酸脱羧酶活性。研究发现仅过表达alsS即可产生异丁醇，与ilvC、ilvD共表达时产量增加近9倍；野生型AlsS的Kdc活性为5.5 μmol·min⁻¹·mg⁻¹，对2-酮异戊酸的Km为300±35 mM，kcat为8.9±1.2 s⁻¹。定点突变表明Q487残基是决定Kdc活性的关键：Q487A/G/S突变体保留Als活性但Kdc活性显著下降，Q487L/I突变体丧失Als活性而Kdc活性与野生型相当，发酵实验中这些突变体几乎不产异丁醇，而Q487N产量与野生型相近。此外，含Kdc的原始菌株24小时产6.8 g/L异丁醇，112小时超过20 g/L。该发现拓展了对AlsS催化机制的理解，为优化异丁醇生物合成途径提供了新策略。

创新点

发现枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶AlsS具有Kdc活性，能够催化2-酮异戊酸脱羧为异丁醛，从而使异丁醇生产无需外源Kdc；通过定点突变确定Q487残基对Kdc活性的重要性。

研究对象（9）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli 异丁醇生物合成途径 alsS AlsS 催化 来自Bacillus subtilis，兼具乙酰乳酸合酶（Als）和2-酮异戊酸脱羧酶（Kdc）活性
Escherichia coli 缬氨酸生物合成途径 ilvC IlvC 催化 乙酰羟基酸异构还原酶
Escherichia coli 缬氨酸生物合成途径 ilvD IlvD 催化 二羟基酸脱水酶
Escherichia coli 异丁醇生物合成途径 kdc Kdc 催化 来自Lactococcus lactis，常规Kdc，本文证明其非必需
Escherichia coli 异丁醇生物合成途径 ADH2 Adh2 催化 来自Saccharomyces cerevisiae，醇脱氢酶，催化异丁醛还原为异丁醇
Escherichia coli 异丁醇生物合成途径 yqhD YqhD 催化 大肠杆菌内源醇脱氢酶，可高效转化异丁醛为异丁醇
Escherichia coli 缬氨酸生物合成途径 ilvI, ilvH IlvI/IlvH 催化 乙酰羟基酸合酶（Ahas），对照实验中代替alsS，不能产生异丁醇
Escherichia coli 丙酮酸代谢 aceE AceE 催化 丙酮酸脱氢酶E1组分，敲除后仍能产生异丁醇，排除其作用
Escherichia coli 三羧酸循环 sucA SucA 催化 2-酮戊二酸脱氢酶E1组分，与aceE一起敲除，不影响异丁醇生产

关键发现

  1. 原始含Kdc途径的大肠杆菌菌株24小时产6.8 g/L异丁醇，112小时超过20 g/L。仅过表达alsS、ilvC和ilvD（无kdc）的菌株仍产生异丁醇，其中单独过表达alsS即可产生异丁醇，而单独过表达ilvC和ilvD不产生
  2. 当alsS与ilvC、ilvD共表达时，异丁醇产量增加近9倍。删除基因组ilvC基因后异丁醇生产废除，表明该途径依赖KIV。体外活性测定显示野生型AlsS的Kdc活性为5.5 μmol·min−1·mg−1。野生型AlsS对丙酮酸的Km为13.6±0.8 mM，kcat为121±13 s−1
  3. 对KIV的Km为300±35 mM，kcat为8.9±1.2 s−1。Q487A、Q487G和Q487S突变体保持Als活性（kcat/Km与丙酮酸接近），但Kdc活性显著下降
  4. Q487L和Q487I突变体则丧失Als活性，但Kdc活性与野生型相当。Q487G和Q487S的Km(KIV)/Km(丙酮酸)比值分别为109±30和140±79，而野生型为20±2.9。在发酵实验中，Q487A、G、S、L、I突变体均几乎不产异丁醇，而Q487N产量与野生型相近。

研究结论

结果表明Kdc并非大肠杆菌异丁醇生产所必需，枯草芽孢杆菌的AlsS可同时承担乙酰乳酸合酶和2-酮异戊酸脱羧酶功能，Q487残基是决定Kdc活性的关键。该发现拓展了对AlsS催化机制的理解，并可能用于优化异丁醇生物合成途径。