Acute limonene toxicity in Escherichia coli is caused by limonene-hydroperoxide and alleviated by a point mutation in alkyl hydroperoxidase (AhpC)
- 作者
- Victor Chubukov, Florence Mingardon, Wendy Schackwitz, Edward E.K. Baidoo, Jorge Alonso-Gutierrez, Qijun Hu, Taek Soon Lee, Jay D. Keasling, Aindrila Mukhopadhyay
- 单位
- Joint BioEnergy Institute, 5885 Hollis St, Emeryville, CA 94608, USA; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA; Total New Energies USA, Inc., 5858 Horton St, Emeryville, CA 94608, USA; Joint Genome Institute, Walnut Creek, CA 94598, USA; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2015）
- DOI
- 10.1128/AEM.01102-15
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析柠檬烯对大肠杆菌产生急性毒性的分子机制，并寻找可缓解毒性的遗传改造靶点。
研究策略
通过柠檬烯平板筛选自发耐受突变菌株，利用全基因组测序鉴定突变基因，构建回补菌株验证功能，并结合代谢物分析和条件实验阐明毒性来源。
核心内容
该研究以大肠杆菌为对象，解析了柠檬烯急性毒性的分子机制并筛选缓解毒性的遗传改造靶点。通过柠檬烯平板筛选自发耐受突变菌株，结合全基因组测序鉴定出ahpC基因的L177Q点突变，该突变位于烷基氢过氧化物还原酶亚基。研究证实柠檬烯毒性主要源于其在有氧条件下自发氧化生成的柠檬烯氢过氧化物，而非柠檬烯本身：氧化柠檬烯样品中氢过氧化物信号增加超过10倍，野生型菌株在0.1% v/v氧化柠檬烯时完全停止生长，而表达AhpC L177Q的菌株可耐受0.5% v/v且生长仅轻微受损。进一步分析显示，13个柠檬烯样品的毒性与氢过氧化物含量显著相关，厌氧储存的柠檬烯几乎无毒性；突变株能在1小时内将细胞内柠檬烯氢过氧化物降至检测限以下。AcrAB外排泵缺失菌株在柠檬烯条件下生长受损且无法被突变恢复，说明外排系统参与但不依赖AhpC功能。尽管突变大幅提升耐受性，在24至72小时发酵中并未显著提高柠檬烯产量。该工作明确了柠檬烯毒性机制，对柠檬烯的微生物生产和抗菌应用具有指导意义。
创新点
首次证明柠檬烯毒性主要来自其自发氧化产物柠檬烯氢过氧化物，而非柠檬烯本身；发现AhpC的L177Q点突变能够高效降解该氢过氧化物，从而显著提高菌株耐受性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | 烷基氢过氧化物还原通路 | ahpC | AhpC | 催化 | 过氧化物还原酶，L177Q突变显著提高对柠檬烯氢过氧化物的还原活性 |
| Escherichia coli BW25113 | 烷基氢过氧化物还原通路 | ahpF | AhpF | 催化 | 为AhpC提供电子，构成烷基氢过氧化物还原酶复合体 |
| Escherichia coli BW25113 | 溶剂外排 | acrA, acrB | AcrA, AcrB | 转运 | AcrAB-TolC外排泵组分，负责外排柠檬烯本身，缺失后AhpC L177Q无法恢复耐受 |
关键发现
- FM003突变株可在含高达5% v/v柠檬烯的液体培养基中生长
- 全基因组测序鉴定出ahpC L177Q（L178Q？原文是L177Q）突变
- 在厌氧条件下柠檬烯毒性依然存在，说明毒性物质在添加前已存在于柠檬烯中
- 氧化柠檬烯样品中氢过氧化物信号增加>10倍
- 野生型E. coli在0.1% v/v氧化柠檬烯时完全抑制生长，而AhpC L177Q表达菌株能耐受0.5% v/v且生长速率仅轻微受损
- 13个柠檬烯样品的毒性与氢过氧化物含量呈显著相关，厌氧储存的柠檬烯对野生型毒性极小
- 在表达AhpC L177Q的菌株中，细胞内柠檬烯氢过氧化物在加入1%部分氧化柠檬烯后1小时内降至检测限以下，而对照菌株保持高浓度并生长受损
- ΔacrA或ΔacrB菌株在柠檬烯条件下生长显著受损，但表达AhpC L177Q不能恢复其耐受
- 在24-72小时批量培养中，表达AhpC L177Q没有显著提高柠檬烯产量。
研究结论
柠檬烯的急性毒性主要由其在有氧条件下自发氧化生成的柠檬烯氢过氧化物引起，而非柠檬烯本身。AhpC的L177Q突变通过增强对柠檬烯氢过氧化物的还原活性缓解毒性。这些发现对柠檬烯的微生物生产及抗菌应用有重要指导意义。