Adjustment of Trehalose Metabolism in Wine Saccharomyces cerevisiae Strains To Modify Ethanol Yields
- 作者
- D. Rossouw, E. H. Heyns, M. E. Setati, S. Bosch, F. F. Bauer
- 单位
- Institute for Wine Biotechnology, University of Stellenbosch, Stellenbosch, South Africa
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2013）
- DOI
- 10.1128/AEM.00964-13
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在葡萄酒发酵中通过调整海藻糖代谢来降低乙醇产量，同时避免发酵停滞和不良副产物积累
研究策略
利用EUROSCARF缺失突变体库筛选中心碳代谢相关基因的66个单缺失菌株，根据乙醇产量变化选出候选基因；随后在工业葡萄酒酵母菌株VIN13中利用生长阶段特异性低强度启动子（DUT1和GIP2）适度上调TPS1基因表达，验证其对乙醇产量的影响
研究路线图
核心内容
本研究利用EUROSCARF缺失突变体库，对66个中心碳代谢相关基因进行无偏倚筛选，以鉴定影响葡萄酒发酵乙醇产量的关键基因。结果发现TPS1、TDH3、ZWF1、ACO1和ACO2五个基因与乙醇产量显著相关，其中tps1Δ和tdh3Δ降低乙醇产量，而zwf1Δ、aco1Δ和aco2Δ则升高产量。随后在工业葡萄酒酵母菌株VIN13中，利用生长阶段特异性低强度启动子DUT1和GIP2适度上调TPS1表达，分别使指数期和稳定期TPS1表达量提高2倍以上和60%，两个工程菌株在发酵结束时乙醇产量显著低于对照，且海藻糖积累增加，甘油和乙酸水平无不良变化，质粒保留率超过95%。在实验室菌株BY4742中，多拷贝质粒过表达TPS1使相对乙醇产量降至0.88。此外adh1Δ突变体出现严重发酵停滞，残糖高达124.6 g/L。研究表明通过系统筛选靶基因并结合适度、阶段特异性表达调控，可在不干扰氧化还原平衡和副产物积累的前提下有效降低乙醇产量，为开发低醇葡萄酒酵母提供了可行策略。
创新点
首次采用无偏倚的系统筛选策略对66个中心碳代谢缺失突变体进行葡萄酒发酵条件下乙醇产量筛选；使用低强度、生长阶段特异性启动子（DUT1和GIP2）对TPS1进行适度上调，避免了多拷贝质粒和强过表达带来的代谢负担；成功在工业酵母中通过调控海藻糖代谢实现降低乙醇产量，且未影响氧化还原平衡和产生不良副产物
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母BY4742 | 海藻糖代谢 | TPS1 | 海藻糖-6-磷酸合酶 | 催化 | 缺失导致乙醇产量降低，过表达（多拷贝PGK1启动子）导致乙醇产量相对值降至0.88 |
| 酿酒酵母BY4742 | 糖酵解 | TDH3 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 缺失导致乙醇产量降低，负责约50-60%的甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性 |
| 酿酒酵母BY4742 | 氧化性磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 缺失导致乙醇产量升高 |
| 酿酒酵母BY4742 | TCA循环 | ACO1 | 乌头酸酶1 | 催化 | 缺失导致乙醇产量升高 |
| 酿酒酵母BY4742 | TCA循环 | ACO2 | 乌头酸酶2 | 催化 | 缺失导致乙醇产量升高 |
| 酿酒酵母VIN13 | 海藻糖代谢 | TPS1 | 海藻糖-6-磷酸合酶 | 催化 | 利用DUT1和GIP2低强度启动子适度上调表达，分别使指数期和稳定期表达量提高>2倍和60%，显著降低乙醇产量并增加海藻糖积累 |
| 酿酒酵母BY4742 | 发酵 | ADH1 | 乙醇脱氢酶I | 催化 | 缺失导致发酵停滞，残糖124.6 ± 2.8 g/L，乙醇产量最低 |
关键发现
- 通过筛选66株EUROSCARF缺失突变体，鉴定出5个与乙醇产量显著相关的基因：TPS1、TDH3、ZWF1、ACO1和ACO2。其中tps1Δ和tdh3Δ乙醇产量降低，zwf1Δ、aco1Δ和aco2Δ乙醇产量升高。在工业菌株VIN13中，利用DUT1启动子驱动TPS1表达在指数期比野生型高>2倍，利用GIP2启动子在稳定期高60%
- 两个过表达菌株(DUT-TPS和GIP-TPS)发酵结束时乙醇产量显著低于对照，同时海藻糖积累增加，甘油和乙酸水平无不良变化。质粒保留率>95%。在实验室菌株BY4742中，多拷贝质粒过表达TPS1的相对乙醇产量为0.88、乙醇产率为0.90（相对于空质粒对照）。此外，adh1Δ突变体残糖高达124.6 ± 2.8 g/L，发酵停滞
- tps1Δ产生的甘油量约为野生型的2倍
研究结论
通过系统筛选缺失突变体库并结合生长阶段特异性适度上调TPS1基因表达，可在不干扰氧化还原平衡和产生不良副产物的情况下显著降低葡萄酒发酵中的乙醇产量，为开发低醇葡萄酒酵母提供了可行策略和新的靶点