Five-Carbon Alcohols are Produced from Isopentenyl Diphosphate using a Synthetic Pathway
- 作者
- Howard H. Chou, Jay D. Keasling
- 单位
- UCSF-UCB Joint Graduate Group in Bioengineering, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA 94720; Synthetic Biology Engineering Research Center, University of California, Berkeley, CA 94720, USA; Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720; California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, Berkeley, CA 94720; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2012）
- DOI
- 10.1128/AEM.01175-12
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从异戊烯基二磷酸（IPP）出发构建合成途径生产三种五碳醇（3-甲基-3-丁烯醇、3-甲基-2-丁烯醇和3-甲基丁醇），需要发现能够催化新反应（IPP/DMAPP去磷酸化、3-甲基-2-丁烯醇还原）的酶，并解决与内源途径竞争共同底物IPP和DMAPP的问题。
研究策略
基于代谢途径和酶进化的“拼接进化”模型，利用酶超家族作为小型靶向文库（23个HAD样磷酸酶和13个Nudix水解酶）筛选新酶活性；构建Idi-NudB双功能融合蛋白以有效竞争IPP和DMAPP；整合NemA还原酶组装完整合成途径。
核心内容
本研究在大肠杆菌中构建了一条从异戊烯基二磷酸（IPP）合成三种五碳醇（3-甲基-3-丁烯醇、3-甲基-2-丁烯醇和3-甲基丁醇）的新途径。作者基于酶超家族的“拼接进化”模型，将23个HAD样磷酸酶和13个Nudix水解酶组成小型靶向文库进行筛选，鉴定出7个酶能催化IPP去磷酸化生成3-甲基-3-丁烯醇，其中NudB活性最佳，其对IPP的Km为4.7 μM，产量达对照的5倍。进一步鉴定出NemA能催化3-甲基-2-丁烯醇还原为3-甲基丁醇，24小时转化率为40%。为解决与内源途径竞争共同底物IPP和DMAPP的问题，作者构建了Idi-NudB双功能融合蛋白，使C5醇产量比单独表达提高2倍以上，其中Idi1-NudB比Idi-NudB再提高40%。过表达NudB时，3-甲基-3-丁烯醇产量达55 mg/L（2 g/L葡萄糖），为理论最大产率的8.3%。该工作验证了利用酶家族库发现新催化活性的框架，并通过融合蛋白策略有效重定向代谢通量，为从IPP出发合成其他异戊二烯类化合物提供了通用策略。
创新点
1. 提出并验证了利用酶家族作为小规模靶向文库来发现新酶反应活性的框架；2. 首次鉴定出能催化IPP/DMAPP去磷酸化的酶（如NudB）和能还原3-甲基-2-丁烯醇的酶（NemA）；3. 通过双功能融合蛋白策略重定向代谢通量，克服了内源竞争；4. 成功实现了从IPP合成三种五碳醇。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | atoB | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 合成IPP的甲羟戊酸途径基因之一 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | hmgs | HMG-CoA合酶 | 催化 | 合成IPP的甲羟戊酸途径基因之一 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | hmgr | HMG-CoA还原酶（截短） | 催化 | 合成IPP的甲羟戊酸途径基因之一 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | mk | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 合成IPP的甲羟戊酸途径基因之一 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | pmk | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 合成IPP的甲羟戊酸途径基因之一 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | pmd | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 合成IPP的甲羟戊酸途径基因之一 |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶（Idi） | 催化 | 催化IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | idi1 | 异戊烯基二磷酸异构酶（Idi1） | 催化 | 来自酿酒酵母，催化IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | nudB | Nudix水解酶NudB | 催化 | 催化IPP和DMAPP去磷酸化，Vmax=0.63 nmole/min/mg，Km=4.7 μM |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | had4 | HAD样磷酸酶HAD4 | 催化 | 能催化IPP去磷酸化，产量为对照2倍以上 |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | had10 | HAD样磷酸酶HAD10 | 催化 | 能催化IPP去磷酸化，产量为对照2倍以上 |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | nemA | N-乙基马来酰亚胺还原酶NemA | 催化 | 催化3-甲基-2-丁烯醇还原为3-甲基丁醇，24小时转化率40% |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | idi-nudB（融合基因） | Idi-NudB双功能融合蛋白 | 催化 | 同时具有异构酶和磷酸酶活性，使C5醇产量比单独表达Idi和NudB提高2倍以上 |
| Escherichia coli | C5醇合成途径 | idi1-nudB（融合基因） | Idi1-NudB双功能融合蛋白 | 催化 | 比Idi-NudB进一步提高3-甲基-3-丁烯醇和3-甲基-2-丁烯醇产量40% |
关键发现
- 从36个候选酶（23个HAD样磷酸酶和13个Nudix水解酶）中筛选出7个酶（HAD4、HAD10、NudB、NudF、NudI、NudJ、NudM）能催化IPP去磷酸化产生3-甲基-3-丁烯醇
- 其中NudB效果最佳，产量为对照的5倍
- NudB对IPP的体外动力学参数为Vmax=0.63 nmole/min/mg，Km=4.7 μM
- NemA能催化3-甲基-2-丁烯醇还原为3-甲基丁醇，24小时转化率为40%
- 融合蛋白Idi-NudB使C5醇产量比单独表达Idi和NudB提高2倍以上，Idi1-NudB相比Idi-NudB再提高40%
- 过表达NudB时，3-甲基-3-丁烯醇产量达55 mg/L（2 g/L葡萄糖），为理论最大产率的8.3%
- 过表达Idi1-NudB和NemA时达到理论最大产率的4.8%。
研究结论
成功构建了一条从IPP合成3-甲基-3-丁烯醇、3-甲基-2-丁烯醇和3-甲基丁醇的合成途径，验证了利用酶家族筛选新催化活性的框架，并通过双功能融合蛋白有效解决了代谢通量竞争问题，为合成新化合物提供了新策略。