Light-controlled cell factories - Employing photocaged IPTG for light-mediated optimization of lac-based gene expression and (+)-valence biosynthesis in Corynebacterium glutamicum
- 作者
- Dennis Binder, Jonas Frohwitter, Regina Mahr, Claus Bier, Alexander Grünberger, Anita Loeschcke, Petra Peters-Wendisch, Dietrich Kohlmeyer, Jörg Pietruszka, Julia Frunzke, Karl- Erich Jaeger, Volker F. Wendisch, Thomas Drepper
- 单位
- Institute of Molecular Enzyme Technology, Heinrich- Heine- University Düsseldorf, Forschungszentrum Jülich, 52425 Jülich, Germany; Chair of Genetics of Prokaryotes, Faculty of Biology & CeBiTec, Bielefeld University, Bielefeld 33615, Germany; Institute of Bio- and Geosciences, IBG- 1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich, 52425 Jülich, Germany; Institute for Bioorganic Chemistry, Heinrich- Heine- University Düsseldorf, Forschungszentrum Jülich, 52245 Jülich, Germany
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.01457-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
谷氨酸棒状杆菌中常规IPTG诱导系统存在诱导性差、表达异质性等缺点，限制了有毒化合物(+)-瓦伦烯的高效生产；需要建立精确、均一且非侵入性的诱导方法。
研究策略
采用光笼IPTG（clPTG）作为光敏诱导剂，在UV-A光照射下释放IPTG，从而将tac启动子系统转换为光控表达系统；结合异源MEP途径基因过表达和发酵条件优化，提高(+)-瓦伦烯产量。
核心内容
本研究在谷氨酸棒状杆菌中建立了一种基于光笼IPTG的光控基因表达系统，用以替代传统IPTG诱导的不足。作者利用UV-A光照射光笼IPTG释放游离IPTG，实现了对tac启动子系统的时间和强度依赖调控。实验表明，在BHI培养基中光诱导的表达量最高可达传统IPTG的6倍，在CGXII培养基中为3至4倍，且CGXII中光诱导的动态范围达到239倍，远高于IPTG的46倍。单细胞水平分析显示光诱导产生均一表达，而IPTG诱导则存在明显异质性。将这一光控系统与dxs、idi过表达及密码子优化的(+)-瓦伦烯合酶结合，在0.1 mM光笼IPTG、4小时光照和100%光强条件下，(+)-瓦伦烯产量达到41.0 mg/L，较IPTG诱导的7.2 mg/L提高约6倍，较文献报道值提升17倍，体积产率为1.46 mg/L/h。同时，光诱导对细胞生长的抑制更小。该策略证明光笼IPTG可作为一种精准、均一且温和的诱导工具，为有毒萜类化合物的微生物异源合成提供了新的调控思路。
创新点
首次在C. glutamicum中验证光笼IPTG的可行性，实现光强度和时间依赖的基因表达调控；光诱导显著改善表达均一性和动态范围；通过光控策略将(+)-瓦伦烯产量提高约6倍。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 过表达以增强IPP和DMAPP前体供应 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 过表达以增强IPP和DMAPP前体供应 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 法尼基焦磷酸(FPP)合成 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 来源于大肠杆菌，催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 倍半萜生物合成 | oCnVS | (+)-瓦伦烯合酶 | 催化 | 来自Callitropsis nootkatensis，密码子优化，催化FPP环化生成(+)-瓦伦烯 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | tac启动子表达系统 | lacI | 乳糖阻遏蛋白 | 调控 | 阻遏tac启动子，被IPTG或光解释放的IPTG解除抑制 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 基因缺失，避免副产物GGPP生成 |
| Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 | 类胡萝卜素生物合成 | idsA | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 基因缺失，避免副产物GGPP生成 |
关键发现
- 在BHI培养基中，光诱导在指数中后期明显优于IPTG，最高可达6倍表达量；在CGXII培养基中可达3-4倍。动态范围在CGXII中为239倍（clPTG）对比46倍（IPTG）。单细胞分析表明光诱导产生均一表达，而IPTG诱导产生异质性。通过光笼IPTG诱导结合dxs、idi过表达和密码子优化的(+)-瓦伦烯合酶，最优条件（0.1 mM clPTG，4h光照，100%光强）获得(+)-瓦伦烯产量41.0 ±
- 1 mg/L，较IPTG诱导的7.2 mg/L提高约6倍，较文献报道的2.4 mg/L提高17倍，体积产率为1.46 mg/L/h。光诱导的生长抑制小于IPTG（μmax
- 34 vs
- 29 h^-1）。
研究结论
光笼IPTG是C. glutamicum中一种高效的光控诱导工具，能实现精确、均一的基因表达，并显著提升有毒倍半萜(+)-瓦伦烯的产量，为微生物细胞工厂的模块化光控生产提供了新策略。