Use of Transposon Promoter-Probe Vectors in the Metabolic Engineering of the Obligate Methanotroph Methylomonas sp. Strain 16a for Enhanced C40 Carotenoid Synthesis
- 作者
- Pamela L. Sharpe, Deana DiCosimo, Melissa D. Bosak, Kyle Knoke, Luan Tao, Qiong Cheng, Rick W. Ye
- 单位
- Biochemical Sciences and Engineering, Central Research and Development, E. I. DuPont de Nemours Inc., Wilmington, Delaware 19880-0328
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2007）
- DOI
- 10.1128/AEM.01332-06
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在严格甲烷氧化菌Methylomonas sp. strain 16a中，如何鉴定支持外源基因高表达的染色体位点，以实现C40类胡萝卜素（角黄素和虾青素）的高效、稳定合成，同时消除对抗生素抗性标记的依赖。
研究策略
利用基于Tn5的无启动子转座子携带C40类胡萝卜素基因簇随机插入Methylomonas基因组，通过筛选深色菌落鉴定高表达染色体区域；在此基础上，采用基于蔗糖致死的pGP704-sacB整合系统进行无标记基因删除或定点整合。
核心内容
该研究以严格甲烷氧化菌Methylomonas sp. strain 16a为宿主，旨在解决外源基因在染色体上高表达位点难以鉴定、以及抗生素抗性标记依赖的问题，从而实现C40类胡萝卜素的高效稳定合成。研究者构建了基于Tn5的无启动子转座子启动子探针载体，携带完整的C40类胡萝卜素基因簇随机插入基因组，通过深色菌落筛选鉴定出fliCS、hsdM、ccp-3、cysH和nirS五个支持高表达的染色体区域。其中最优菌株MCIS1801的总类胡萝卜素滴度约2.0 mg/g DCW，比氯霉素启动子对照提高10到20倍，也高于高拷贝质粒表达约一倍，而染色体整合至ald区域的对照产量仅约0.1 mg/g DCW，表明插入位点对表达水平影响显著。随后利用pGP704-sacB蔗糖致死系统在优质位点实现无标记的基因整合，成功获得了不含抗生素抗性基因的角黄素和虾青素高产菌株。这项工作证明了无启动子转座子筛选与无标记整合系统相结合的策略，可有效用于难操作环境微生物的代谢工程改造。
创新点
构建无启动子转座子启动子探针载体，无需预知强启动子即可随机筛选高表达染色体位点；鉴定出五个支持类胡萝卜素基因高表达的染色体区域；结合蔗糖致死系统实现无抗生素抗性标记的染色体整合，适用于大规模发酵和监管审批。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylomonas sp. strain 16a | C40类胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 (GGPP synthase) | 催化 | 催化两分子法尼基焦磷酸生成香叶基香叶基焦磷酸，C40合成第一步 |
| Methylomonas sp. strain 16a | C40类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 (phytoene synthase) | 催化 | 将GGPP转化为八氢番茄红素 |
| Methylomonas sp. strain 16a | C40类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 (phytoene dehydrogenase) | 催化 | 将八氢番茄红素转化为番茄红素 |
| Methylomonas sp. strain 16a | C40类胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素环化酶 (lycopene cyclase) | 催化 | 将番茄红素转化为β-胡萝卜素 |
| Methylomonas sp. strain 16a | C40类胡萝卜素生物合成 | crtW | β-胡萝卜素酮化酶 (β-carotene ketolase) | 催化 | 催化β-胡萝卜素转化为角黄素 |
| Methylomonas sp. strain 16a | C40类胡萝卜素生物合成 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 (β-carotene hydroxylase) | 催化 | 催化β-胡萝卜素/角黄素转化为虾青素途径 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 类异戊二烯途径 | idI | 异戊烯焦磷酸异构酶 (isopentenyl pyrophosphate isomerase) | 催化 | 在crt334基因簇中，增强IPP/DMAPP供应 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 鞭毛合成与运动 | fliC | 鞭毛蛋白 (flagellin) | 调控 | 转座子插入位点，其启动子驱动外源类胡萝卜素基因高表达 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 鞭毛合成与运动 | fliS | 鞭毛蛋白输出伴侣 (flagellar export chaperone) | 调控 | 转座子插入位点，支持高水平类胡萝卜素合成 |
| Methylomonas sp. strain 16a | DNA限制修饰系统 | hsdM | II型限制修饰系统甲基化酶 | 调控 | 插入位点位于该区域（如mst1132上游），提供强表达 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 氧化还原平衡 | ccp-3 | 细胞色素c过氧化物酶 | 调控 | Tn334插入位点，多个菌株中表达增强 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 硫代谢 | cysH | 磷酸腺苷磷酸硫酸还原酶 | 调控 | 位于mst2848上游，插入支持高表达 |
| Methylomonas sp. strain 16a | 氮代谢 | nirS | 亚硝酸还原酶 | 调控 | Tn377插入位点，与ccp-3菌株组合使用 |
| Methylomonas sp. strain 16a | C30类胡萝卜素合成 | crtNc | C30类胡萝卜素氧化酶 | 催化 | 删除该基因以阻断C30合成 |
关键发现
- 通过无启动子转座子筛选，在Methylomonas sp. strain 16a中鉴定出fliCS、hsdM、ccp-3、cysH和nirS五个染色体区域，这些区域能使总类胡萝卜素产量提高10-20倍（与氯霉素启动子对照相比）。最优菌株MCIS1801（Tn334插入fliS）总类胡萝卜素滴度约2.0 mg/g DCW
- 部分插入位点产量比高拷贝质粒表达（约1.0 mg/g DCW）高约2倍。染色体整合至ald区域的Cat333产量仅约0.1 mg/g DCW，比质粒表达低约90%。其他菌株（如MCIS1701、MCIS1702）产量在1.1-1.9 mg/g DCW之间。成功实现无抗生素抗性标记的角黄素和虾青素合成。
研究结论
证明了无启动子转座子结合无标记整合系统可高效鉴定宿主染色体高表达位点，用于代谢工程改造难操作的环境微生物，成功获得高产C40类胡萝卜素且不含抗生素抗性基因的Methylomonas菌株。