Cloning of a Novel Pyrethroid-Hydrolyzing Carboxylesterase Gene from Sphingobium sp. Strain JZ-1 and Characterization of the Gene Product
- 作者
- Bao-zhan Wang, Peng Guo, Bao-jian Hang, Lian Li, Jian He, Shun-peng Li
- 单位
- Key Laboratory of Microbiological Engineering of Agricultural Environment, Ministry of Agriculture, Life Sciences College of Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095, People's Republic of China
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2009）
- DOI
- 10.1128/AEM.01298-09
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
拟除虫菊酯农药在环境中残留造成生态与健康风险，需要获得能够高效、广谱降解此类污染物的新型酯酶。
研究策略
采用富集培养从污泥中分离拟除虫菊酯降解菌，通过构建基因组文库筛选水解酶基因，在大肠杆菌中异源表达，利用Ni-NTA亲和层析纯化，并进行系统的酶学表征。
核心内容
从污泥中分离到一株拟除虫菊酯降解菌Sphingobium sp. JZ-1，并从中克隆到一个新的羧酸酯酶基因pyTH。该基因全长840 bp，编码280个氨基酸，推测蛋白含经典的Ser78、Asp202、His230催化三联体和GHSLG保守基序。在大肠杆菌中异源表达后，通过Ni-NTA亲和层析纯化得到重组酶PyTH。该酶为单体，分子量仅约31 kDa，是已知最小的拟除虫菊酯水解酶之一；最适pH为7.5，在pH 5.5～9.0范围内孵育4小时可保留超过80%活性，50℃以下稳定。动力学分析显示，PyTH对氯氰菊酯和氯菊酯的kcat/Km分别约为23和48.90 μM⁻¹·s⁻¹，显著高于已报道同类酶。该酶对p-硝基苯乙酸酯的比活达351 μmol/min/mg，且对甲氰菊酯和氰戊菊酯的各立体异构体水解速率几乎相同，表明无异构体选择性。这些特性使PyTH在环境及农产品中拟除虫菊酯残留的生物降解方面具有良好应用潜力。
创新点
首次从Sphingobium属菌株中克隆到拟除虫菊酯水解羧酸酯酶基因pyTH；该酶分子量仅约31 kDa，是已知最小的拟除虫菊酯水解酶之一；催化效率高，且无异构体选择性，可广谱降解多种拟除虫菊酯。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sphingobium sp. JZ-1 | 拟除虫菊酯水解降解通路 | pyTH | PyTH (羧酸酯酶) | 催化 | 原始菌株，编码新型拟除虫菊酯水解羧酸酯酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | pyTH | PyTH (重组蛋白) | 催化 | 重组表达并纯化的目标酶 |
关键发现
- 从Sphingobium sp. JZ-1克隆到840 bp的酯酶基因pyTH，编码280个氨基酸；PyTH与α/β水解酶折叠蛋白同源性为20-24%，含Ser78、Asp202、His230催化三联体和GHSLG保守序列。重组PyTH为单体，分子量约31 kDa，pI
- 85；最适pH
- 5，在pH
- 5-9.0范围内孵育4 h保留>80%活性；50°C以下稳定，60°C保留55%活性，70°C完全失活。对permethrin的kcat/Km为48.90 μM⁻¹·s⁻¹，对cypermethrin约为23 μM⁻¹·s⁻¹，比已报道的拟除虫菊酯水解酶高4.7-82.1倍和17.5-34.3倍；对p-硝基苯乙酸酯比活351 μmol/min/mg，kcat为183 s⁻¹。酶活性不受EDTA和1,10-菲啰啉影响，但被PMSF、DEPC、pCMB等抑制。对fenpropathrin和fenvalerate的各立体异构体水解速率几乎相同，无异构体选择性。
研究结论
成功克隆并表征了一种新型拟除虫菊酯水解羧酸酯酶PyTH，该酶分子量小、催化效率高、底物谱广且无异构体选择性，在土壤、沉积物及农产品中拟除虫菊酯残留的清除方面具有良好的应用潜力。