Synthesis of heterologous mevalonic acid pathway enzymes in Clostridium ljungdahlii for the conversion of fructose and of syngas to mevalonate and isoprene
- 作者
- Bruce A. Diner, Janine Fan, Miles C. Scotcher, Derek H. Wells, Gregory M. Whited
- 单位
- Central Research and Development, Biochemical Sciences and Engineering, E. I. du Pont de Nemours and Co., Wilmington, DE 19803; Industrial Biosciences, E. I. du Pont de Nemours and Co., Palo Alto, CA 94304
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.01723-17
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现利用廉价底物（果糖和合成气）在产乙酸菌 Clostridium ljungdahlii 中生产高需求化学品异戊二烯及其前体甲羟戊酸
研究策略
构建携带异源真核甲羟戊酸途径基因（mvaE、mvaS、mvk、pmk、mvd）及 idi、ispS 的 Clostridium-E. coli 穿梭质粒，通过电穿孔导入 C. ljungdahlii，利用果糖或合成气培养，评估异源酶表达与产物合成
核心内容
研究首次在产乙酸菌Clostridium ljungdahlii中功能性表达了完整的异源真核甲羟戊酸（MVA）途径及异戊二烯合酶，利用电穿孔导入携带mvaE、mvaS、mvk、pmk、mvd、idi和ispS基因的穿梭质粒，分别以果糖和合成气（CO/H₂/CO₂）为底物评估产物合成。结果显示，pJF100转化株在果糖培养时产生约0.3 mg/mL（2 mM）甲羟戊酸，野生型不产；携带pJF100 Fdii及N端His标签IspS的转化株在合成气培养下异戊二烯产量为野生型的5.2±1.5倍，CO消耗率约42-58%，且CO₂/CO摩尔比≤0.44，表明CO被固定为生物质和产物。外源添加甲羟戊酸时双转化株可产生约140 ng/mL顶空异戊二烯，但高浓度甲羟戊酸抑制生长。该研究证明了混合营养生长可固定糖酵解释放的CO₂，但产量远低于商业化要求，后续可通过辅因子替换、ATP供给优化及CO₂回补策略提升产率。
创新点
首次在产乙酸菌 C. ljungdahlii 中功能性表达完整的异源真核 MVA 途径及异戊二烯合酶，实现从合成气（CO/H₂/CO₂）和果糖合成甲羟戊酸和异戊二烯；证明该菌混合营养生长可固定糖酵解释放的 CO₂，为提升碳转化率提供可能
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium ljungdahlii | 甲羟戊酸途径（上游） | mvaE, mvaS | MvaE, MvaS | 催化 | 来自粪肠球菌；MvaE 为乙酰-CoA 乙酰转移酶/HMG-CoA 还原酶融合蛋白，MvaS 为 HMG-CoA 合酶，催化乙酰-CoA 合成甲羟戊酸 |
| Clostridium ljungdahlii | 甲羟戊酸途径（下游） | mvk, pmk, mvd | MvK, PmK, Mvd | 催化 | mvk 来自 Methanosarcina mazei，pmk/mvd 来自酿酒酵母，共同催化甲羟戊酸磷酸化并脱羧生成 IPP/DMAPP |
| Clostridium ljungdahlii | 异戊二烯合成 | idi, ispS | Idi, IspS | 催化 | idi 来自酿酒酵母（异戊烯基焦磷酸异构酶），ispS 来自 P. alba（异戊二烯合酶），将 IPP/DMAPP 转化为异戊二烯 |
关键发现
- pJF100 转化株在果糖培养时产生约
- 3 mg/mL（2 mM）甲羟戊酸，野生型不产；pJF100 Fdii 转化株在果糖上异戊二烯产量为野生型的 4-5 倍；在合成气（MES-0F，20 h）培养中，pJF100 Fdii N 端 His 标签 IspS 转化株异戊二烯产量为野生型的
- 2±1.5 倍，CO 消耗率约 42-58%，CO₂/CO 摩尔比≤0.44，表明 CO 被固定为生物质和产物；外源添加 10-40 mM 甲羟戊酸时，pJF101+pJF102#4 双转化株产生约 140 ng/mL 顶空异戊二烯（相当于 91 ng/mL 培养液），显著高于无添加对照（≤10%），但≥10 mM 甲羟戊酸抑制生长；果糖培养时甲羟戊酸积累可达约 300 μg/mL，而合成气培养下≤68 μg/mL
研究结论
研究证明了在 C. ljungdahlii 中异源表达 MVA 途径及 Idi/IspS 可将果糖和合成气转化为甲羟戊酸和异戊二烯，但产量远低于商业化要求；提出通过辅因子替换（如 NADH 依赖的 HMG-CoA 还原酶）、ATP 供给优化及混合营养 CO₂ 回补等策略可大幅提升产率