Formation of Isobutene from 3-Hydroxy-3-Methylbutyrate by Diphosphomevalonate Decarboxylase
- 作者
- David S. Gogerty, Thomas A. Bobik
- 单位
- Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, Ames, Iowa 50011
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1128/AEM.01917-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异丁烯是重要的石油基化工原料，目前完全依赖石油生产，不可再生；缺乏高效的生物合成途径，已知的P450rm活性太低且难以异源表达。因此需要发现新的可催化异丁烯生成的酶并加以改造。
研究策略
以酿酒酵母甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（ScMDD）为候选酶，验证其能否将3-羟基-3-甲基丁酸（3-HMB）转化为异丁烯；通过全细胞与纯酶实验确证活性，并利用易错PCR随机突变结合全细胞筛选获得活性提高的突变体。
核心内容
该研究首次揭示酿酒酵母甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（ScMDD）具有催化3-羟基-3-甲基丁酸（3-HMB）脱羧生成异丁烯的新功能。研究者在大肠杆菌中表达His6标记的ScMDD，通过全细胞和纯酶实验确证了该活性，并经GC-MS证实产物为异丁烯，同时对照实验表明反应严格依赖ScMDD、3-HMB和ATP。进一步利用易错PCR随机突变结合全细胞筛选进行定向进化，获得两个单点突变体ScMDD1（I145F）和ScMDD2（R74H），其全细胞产异丁烯速率分别为3,000和5,888 pmol h⁻¹ g cells⁻¹，较野生型提高19倍和38倍；纯化的ScMDD2活性为6.44 pmol min⁻¹ mg⁻¹ protein，较野生型高4.8倍。该发现使ScMDD成为继P450rm之后第二个已知的异丁烯形成酶。由于3-HMB可由L-亮氨酸降解产生，且异丁烯为易分离的气体，该酶在绿色可再生异丁烯生产中具有应用潜力，但当前活性仍比商业化要求低约10⁶倍，需进一步工程改造。
创新点
首次发现ScMDD具有将3-HMB转化为异丁烯的新催化功能；通过定向进化获得两个单点突变体（I145F和R74H），全细胞产异丁烯速率分别提高19倍和38倍；异丁烯为气体，有望通过气态移出简化发酵产物分离并降低生产能耗。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异丁烯合成（3-HMB → 异丁烯） | ERG19 | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（ScMDD） | 催化 | 酿酒酵母来源，N端带6×His标签；催化3-HMB脱羧生成异丁烯和CO2，需ATP。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异丁烯合成 | ERG19（突变体，I145F） | ScMDD1 | 催化 | 易错PCR获得的突变体，全细胞异丁烯生成速率3,000 pmol h^-1 g cells^-1，较野生型提高19倍。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异丁烯合成 | ERG19（突变体，R74H） | ScMDD2 | 催化 | 全细胞速率5,888 pmol h^-1 g cells^-1，比野生型高38倍；纯酶活性6.44 pmol min^-1 mg^-1 protein，但热稳定性下降。 |
| Rhodotorula minuta | 异丁烯合成（异戊酸 → 异丁烯） | P450rm | 细胞色素P450rm | 催化 | 文献中已知的异丁烯形成酶，速率4.8 nmol min^-1 mg^-1，作为对比；膜结合蛋白难以异源表达。 |
| Galactomyces reessii | 亮氨酸降解 / 3-HMB合成 | — | 甲基巴豆酰-CoA水合酶（hydratase） | 催化 | 可将甲基巴豆酸转化为3-HMB，为3-HMB的生物合成提供途径。 |
关键发现
- 表达His6-ScMDD的大肠杆菌全细胞能以154 pmol h^-1 g cells^-1的速率将3-HMB转化为异丁烯；纯化的His6-ScMDD体外活性为1.33 pmol min^-1 mg^-1 protein。通过易错PCR获得的两个突变体ScMDD1（I145F）和ScMDD2（R74H）的全细胞活性分别为3,000和5,888 pmol h^-1 g cells^-1，较野生型提高19倍和38倍；纯化的ScMDD2活性为6.44 pmol min^-1 mg^-1 protein，较野生型高4.8倍。对照实验证实异丁烯生成严格依赖ScMDD、3-HMB和ATP；GC-MS确证产物为异丁烯。300 ml培养物可纯化野生型ScMDD
- 1 mg、ScMDD2
- 7 mg。目前活性仍比商业化所需（2~4 g/L/h）低约10^6倍，但可通过定向进化进一步提升。
研究结论
ScMDD能够催化3-HMB脱羧生成异丁烯，是继P450rm之后第二个已知的异丁烯形成酶；通过定向进化可显著提高该活性。由于3-HMB可由L-亮氨酸降解产生，且异丁烯为易分离的气体，ScMDD在可再生异丁烯生产中具有应用潜力，但还需进一步提高酶活性以满足商业化要求。