高级醇 · 代谢工程文献库

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Metabolic Response of Clostridium ljungdahlii to Oxygen Exposure

作者
Jason M. Whitham, Oscar Tirado-Acevedo, Mari S. Chinn, Joel J. Pawlak, Amy M. Grunden
单位
Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University; Department of Biological and Agricultural Engineering, North Carolina State University; Department of Forest Biomaterials, North Carolina State University; The Procter & Gamble Company
杂志
Applied and Environmental Microbiology（2017）
DOI
10.1128/AEM.02491-15
所属领域
代谢工程
关键词
Aldehyde oxidoreductaseClostridium ljungdahliiEthanolOxygenReactive oxygen speciesRubrerythrinSynthesis gas fermentation
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解决的核心问题

解析Clostridium ljungdahlii在氧气暴露下提高乙醇产量及氧/活性氧解毒的分子机制

研究策略

结合批式发酵、RNAseq差异表达分析和酶活测定，鉴定氧气暴露后差异表达基因及其酶活性

研究路线图

100%
C. ljungdahlii 氧气暴露下乙醇产量升高与氧解毒的分子机制
策略：批式发酵 + RNAseq + 酶活测定
关键发现1：AOR（CLJU_c24130）催化乙酸→乙醛
关键发现2：rubrerythrin（CLJU_c39340）清除H2O2
辅因子和能量代谢联系：CODH复合物 & RNF提供NADH
表型结果：乙醇/乙酸 1:6→1:2；乙醇产量增加；细胞仍存活但生长减慢
分子结果：AOR表达上调~10倍；AOR活性↑4-6倍；NAD(P)H过氧化物酶活性0.93 U/mg
结论与遗传靶点：AOR与rubrerythrin等基因 → 提高乙醇产量与氧耐受
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核心内容

该研究以严格厌氧菌Clostridium ljungdahlii为对象，系统解析了其在氧气暴露下提高乙醇产量并完成氧解毒的分子机制。作者结合批式发酵、RNAseq差异表达分析和酶活测定，发现8%氧气暴露后乙醇/乙酸比从1:6提高到1:2，细胞倍增时间由4.6小时延长至5.8小时，但仍可生长。转录组和酶活证据表明，预测的钼依赖性醛氧化还原酶（CLJU_c24130）是乙醇产量升高的关键，该酶催化乙酸还原为乙醛，其活性在14和36小时分别比厌氧培养高6倍和4倍，对应基因表达量上调约10倍；rubrerythrin（CLJU_c39340）被鉴定为主要过氧化氢清除酶，NAD(P)H过氧化物酶活性约0.93 U/mg，远超C. acetobutylicum的0.023 U/mg。该研究揭示了乙醇合成与氧解毒通过辅因子和能量代谢相互联系的机制，为利用合成气杂质耐受性和定向提高乙醇产量提供了明确的遗传靶点。

创新点

首次鉴定到预测的钼依赖性醛氧化还原酶（CLJU_c24130）在氧气暴露下催化乙酸还原为乙醛，是乙醇产量升高的关键酶；发现rubrerythrin（CLJU_c39340）是细胞应对氧气暴露的主要过氧化氢酶；揭示了乙醇合成与氧解毒通过辅因子和能量代谢相联系的机制

研究对象（12）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 乙醇合成/乙酸还原 CLJU_c24130 醛氧化还原酶 (aldehyde oxidoreductase, AOR) 催化 预测含钼，在8% O2暴露下显著上调，催化乙酸还原为乙醛；14h和36h时乙酸还原酶活性分别提高6倍和4倍
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 氧/ROS解毒 CLJU_c39340 rubrerythrin 催化 NAD(P)H hydrogen peroxidase，在氧气暴露下高表达，SDS-PAGE鉴定为氧诱导蛋白，与C. acetobutylicum的rubperoxin同源
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 乙醇合成 CLJU_c16510 AdhE1 双功能醛/醇脱氢酶 催化 主要的乙醇脱氢酶，但在本研究中未差异表达，可能负责将乙醛还原为乙醇
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 Wood-Ljungdahl通路/CO氧化 CLJU_c09090-110 厌氧型CODH复合物 催化 在8% O2暴露细胞中14h和36h均显著高表达，催化CO氧化产生还原性铁氧还蛋白
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 能量代谢/NAD+还原 CLJU_c11380 RNF复合物G亚基 能量供给 36h显著高表达，参与铁氧还蛋白氧化与NAD+还原偶联，为rubrerythrin提供NADH
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 糖酵解 CLJU_c13400 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 催化 14h在厌氧细胞中表达更高，表明厌氧条件下更依赖糖酵解
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 氧/ROS解毒 CLJU_c21940 推定黄素蛋白 催化 与C. acetobutylicum的flavoprotein (CA_C2449) 同源，可能具有氧化酶活性，由NROR还原
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 氧/ROS解毒 CLJU_c28910 预测rubrerythrin 催化 在氧气暴露下显著上调，但蛋白未在SDS-PAGE中显现明显条带
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 氧/ROS解毒 CLJU_c36090 hemerythrin相关蛋白 催化 在氧气暴露下显著上调，可能与氧运输或H2O2生成有关
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 转录调控/铁代谢 CLJU_c35550 Fur家族转录调控因子 调控 参与铁代谢调控，在氧气暴露下显著上调
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 辅因子修复与金属稳态 CLJU_c19480 含rubredoxin结构域的flavin还原酶样蛋白 催化 属于crm基因簇，可能介导铁蛋白释放铁，参与金属辅因子修复
Clostridium ljungdahlii ATCC 55383 辅因子修复与金属稳态 CLJU_c19490 铁蛋白 ferritin 调控 在crm基因簇中，用于螯合铁离子，减少Fenton反应

关键发现

  1. 8% O2暴露后，乙醇/乙酸比从1:6提高到1:2
  2. 细胞仍能生长但倍增时间从4.6h延长至5.8h
  3. 氢气消耗比厌氧培养减少13%
  4. 至36h时CO、H2、果糖消耗分别比厌氧低7%、19%、25%
  5. CO2产生量减少0.577 g/L
  6. 还原剂最多去除0.9 ppm（39%）的氧，细胞至少去除4.2 mmol/L氧
  7. AOR乙酸还原酶活性在14h和36h时分别比厌氧培养高6倍和4倍
  8. NAD(P)H过氧化物酶活性约0.93 U/mg，远高于C. acetobutylicum的0.023 U/mg
  9. CLJU_c24130在36h表达量比厌氧培养高约10倍（log2 FC -2.991）
  10. CLJU_c39340在14h表达量显著上调（log2 FC -2.905）。

研究结论

C. ljungdahlii通过上调钼依赖性醛氧化还原酶（CLJU_c24130）和rubrerythrin（CLJU_c39340）等基因，将乙酸还原为乙醇并清除过氧化氢，从而耐受低浓度氧气并提高乙醇/乙酸比；为改造菌株提高乙醇产量和耐受合成气杂质提供了遗传靶点。