In Vivo Evolution of Butane Oxidation by Terminal Alkane Hydroxylases AlkB and CYP153A6
- 作者
- Daniel J. Koch, Mike M. Chen, Jan B. van Beilen, Frances H. Arnold
- 单位
- California Institute of Technology, Pasadena, California 91125; Université de Lausanne, Lausanne, Switzerland
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2008）
- DOI
- 10.1128/AEM.01758-08
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何通过定向进化将中链烷烃末端羟化酶AlkB和CYP153A6改造为高效氧化小分子烷烃（如丁烷）的末端羟化酶，同时保持对末端位置的高选择性。
研究策略
构建P. putida GPo12(pGEC47ΔB)底盘菌株，该菌株缺失alkB但保留其他烷烃降解基因，只能利用末端醇生长；通过随机质粒突变建立突变体文库，以丁烷为唯一碳源进行生长选择，富集能氧化丁烷的突变体。
核心内容
本研究利用体内定向进化策略，将中链烷烃末端羟化酶AlkB和CYP153A6改造为高效氧化丁烷的末端羟化酶。研究者构建了缺失alkB但保留其他烷烃降解基因的恶臭假单胞菌GPo12(pGEC47ΔB)底盘菌株，该菌株仅能利用末端醇生长，通过随机质粒突变建立突变体文库，并以丁烷为唯一碳源进行生长选择，从而富集能氧化丁烷的突变体。关键结果显示，AlkB-BMO2在丁烷生物转化中30分钟产生1580 μM 1-丁醇，活性达15.7 μmol/min/g细胞干重，为野生型6.1 μmol/min/g的2.6倍；CYP153A6-BMO1的1-丁醇生产速率为49 min⁻¹，较野生型28 min⁻¹提高75%，末端选择性从78%提升至89%，其45°C半衰期也从367分钟延长至638分钟。突变位点包括AlkB的L132V、V129M+I233V及CYP153A6的A94V。这些结果表明，基于生长互补的体内进化系统能有效提升小烷烃羟化酶活性并维持末端选择性，为从天然气直接制备液体燃料或化学品提供了可行途径。
创新点
建立了基于生长互补的体内定向进化系统；获得首个CYP153家族中能氧化丁烷的突变体CYP153A6-BMO1；突变不仅提高活性还提高末端羟基化选择性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida GPo12(pGEC47ΔB) | 烷烃降解通路 | alkB | AlkB | 催化 | 膜结合双铁末端烷烃羟化酶，经定向进化获得突变体AlkB-BMO1(L132V)和AlkB-BMO2(V129M+L132V+I233V)，提高对丁烷的氧化活性。 |
| Pseudomonas putida GPo12(pGEC47ΔB) | 烷烃降解通路 | cyp153A6 | CYP153A6 | 催化 | 可溶性细胞色素P450末端烷烃羟化酶，突变体CYP153A6-BMO1(A94V)获得丁烷氧化能力，并提高末端选择性。 |
关键发现
- AlkB-BMO2在丁烷生物转化中30分钟产生1580 μM 1-丁醇，活性为15.7 μmol/min/g细胞干重，是野生型（6.1 μmol/min/g）的2.6倍
- AlkB-BMO1活性9.5 μmol/min/g。CYP153A6-BMO1的1-丁醇生产速率49 min^-1，比野生型28 min^-1提高75%
- 末端选择性从78%提高到89%。CYP153A6-BMO1在45°C的半衰期638 min，野生型367 min。突变位点：AlkB-BMO1为L132V，AlkB-BMO2为V129M+L132V+I233V
- CYP153A6-BMO1为A94V（对应A97V）。
研究结论
通过体内定向进化成功提高了AlkB和CYP153A6对丁烷的氧化活性，并保持了末端羟基化选择性，证明了该进化系统可用于工程化小烷烃羟化酶，为从天然气制备液体燃料或化学品提供可能。