Genome Shuffling in Clostridium diolis DSM 15410 for Improved 1,3-Propanediol Production
- 作者
- Burkhard Otte, Eike Grunwaldt, Osama Mahmoud, Stefan Jennewein
- 单位
- Fraunhofer Institut für Molekularbiologie und Angewandte Ökologie, Forckenbeckstrasse 6, 52074 Aachen, Germany
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2009）
- DOI
- 10.1128/AEM.01774-09
- 所属领域
- 代谢工程 / 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
严格厌氧菌Clostridium diolis DSM 15410发酵甘油生产1,3-丙二醇时，受到高浓度底物、产物及副产物有机酸的抑制，导致产量和产率不足以与化学法竞争。
研究策略
采用化学诱变（NTG）提高菌株对甘油和1,3-丙二醇的耐受性，再通过原生质体融合进行多轮基因组改组，结合高通量筛选和耐受性选择，逐步累积有益突变并消除中性/有害突变。
研究路线图
核心内容
该研究以严格厌氧菌Clostridium diolis DSM 15410为对象，针对其发酵甘油产1,3-丙二醇时受底物、产物及有机酸抑制导致产量偏低的问题，采用化学诱变结合原生质体融合的基因组改组策略进行菌株改良。研究者先用NTG诱变筛选出甘油耐受突变株，再通过多轮递归原生质体融合累积有益突变，并建立基于96深孔板的高通量筛选和GC-MS快速检测方法。经过四轮改组获得的菌株GSHM 4在补料分批发酵中1,3-丙二醇产量达1114 mM（约85 g/L），比野生型的624 mM提高约80%；GSHM 2产量为1032 mM，摩尔产率为0.642，体积产率2.821 g/(L·h)。在粗甘油发酵中GSHM 2产量706 mM，也显著高于野生型的448 mM。这是基因组改组首次成功应用于严格厌氧微生物，证明该方法能有效提升菌株耐受性和产物产量，为1,3-丙二醇的生物法生产提供了可行改良途径，并具备应用粗甘油的工业化潜力。
创新点
首次将基因组改组应用于严格厌氧微生物；结合化学诱变与递归原生质体融合，显著提高1,3-丙二醇的耐受性和产量；建立基于96深孔板的高通量筛选方法，并采用GC-MS快速检测产物。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium diolis DSM 15410 | 甘油厌氧发酵产1,3-丙二醇途径 | — | 甘油脱水酶 | 催化 | 将甘油转化为3-羟基丙醛，是1,3-丙二醇合成途径的关键酶 |
| Clostridium diolis DSM 15410 | 甘油厌氧发酵产1,3-丙二醇途径 | — | 1,3-丙二醇氧化还原酶 | 催化 | 将3-羟基丙醛还原为1,3-丙二醇（原文未明确命名，但依据途径常识补充） |
| Clostridium diolis DSM 15410 | 有机酸代谢（副产物） | — | — | 调控 | 基因组改组改变了乙酸/丁酸代谢谱，GSHM 2产乙酸多，GSHM 4产丁酸多，说明相关代谢调控发生变化 |
| Clostridium diolis DSM 15410 | 底物与产物转运/耐受相关 | — | — | 转运 | 基因组改组获得的菌株对甘油和1,3-丙二醇耐受性显著提高，可能与膜转运或外排系统改进有关 |
关键发现
- 经过四轮基因组改组，菌株GSHM 4在补料分批发酵中1,3-丙二醇产量达到1114 mM（约85 g/L），相比野生型菌株（624 mM）提高80%
- GSHM 2产量为1032 mM，摩尔产率Y1,3-PD分别为0.632和0.642，体积产率分别为2.745和2.821 g/(L·h)。化学诱变获得的甘油耐受突变株98在批量发酵中产量达597 mM（野生型328 mM），产率比0.50。突变株PSM 7经高通量筛选获得，在补料分批发酵中产量为746 mM。全部分子改造成果也体现在粗甘油发酵中，GSHM 2产量706 mM，野生型448 mM，摩尔产率分别为0.49和0.46。
研究结论
基因组改组是一种有效且可靠的菌株改良方法，能够显著提升严格厌氧菌C. diolis的1,3-丙二醇产量和耐受性，且可应用于粗甘油底物；进一步优化发酵条件和基因组改组轮次有望实现工业化。